Stwierdzono jednak, że wytwarzanie mediatora aktywowanego przez IC zostało znacznie zwiększone o dodatkowy rhC5a. Ponadto analiza RNA wykazała silny wkład kinetyczny, który spowodował gwałtownie wyraźną indukcję transkrypcyjną TNF-a / MIP-2 (Figura 4b). Te odkrycia sugerują, że wiązanie rhC5a do C5aR wzmacnia aktywację AM za pośrednictwem IC poprzez modulację FcyRs in vitro. Figura 4rhC5a wzmacnia zależną od FcyRIII aktywację IC AM w warunkach in vitro. (a) Komórki AM MH-S hodowano w pożywce zawierającej 1% FCS, stymulowano (czarne słupki, + rhC5a) lub nie (białe słupki, a rhC5a) za pomocą 50 ng / ml rekombinowanej ludzkiej C5a przez 2 godziny i badano na rhC5a zależne zmiany w mRNA FcyRII / III znormalizowanym względem a-tubuliny za pomocą TaąMan RT-PCR. (b) Komórki MH-S hodowane w FCS (kontrolna pożywka, puste kółka) inkubowano we wskazanych punktach czasowych z rhC5a (wypełnione kółka), zagregowaną cieplnie IgG (IC, otwarte kwadraty) lub kombinacją obu bodźców (wypełnione kwadraty) i analizowane pod kątem wytwarzania MIP-2 / TNF-a mRNA za pomocą TaąMan RT-PCR (górne panele) i MIP-2 / TNF-a białko metodą ELISA (dolne panele). Wyniki wyrażono jako średnie. SEM z trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w dwóch powtórzeniach. Istotne różnice zostały określone za pomocą testu ucznia (* P <0,05; ** P <0,001). Zwróć uwagę na szybszą indukcję MIP-2 i TNF-a. mRNA korelujący ze znacznie zwiększonym MIP-2 / TNF-a stężenia białka w supernatantach hodowli ICs + rhC5a w porównaniu z grupami traktowanymi IC. rhC5a reguluje ekspresję aktywującego FcyRIII i hamującego FcyRII na AM in vivo. Ponieważ rhC5a jest krytycznym regulatorem ekspresji mRNA FcyRII / III w hodowanych komórkach MH-S wzmagających wytwarzanie cytokin wywołanych przez IC, spekulowaliśmy, że rhC5a może również regulować aktywujące FcyRIII i hamujące receptory FcyRII na AM in vivo. W związku z tym poddano analizie wywołane rhC5a zmiany ekspresji FcyR przez TaąMan RT-PCR i cytometrię przepływową (Figura 5). W AM wszystkich myszy B6 WT analizowanych, ekspresja mRNA FcyRIII i FcR. łańcuch był znacznie podwyższony, podczas gdy mRNA FcyRII był tłumiony po dotchawiczym podaniu rhC5a (Figura 5a). Zmutowane myszy C5aR nie wykazywały takich zmian (Figura 5a). Zgodnie z regulowaną ekspresją mRNA stwierdzono, że ekspresja powierzchniowa AM białek FcyRII / III jest odwrotnie regulowana przez rhC5a, który był nieobecny w C5aRc / p. myszy (Figura 5b). Ponieważ mAb 2,4 G2 reaguje krzyżowo zarówno z FcyRII, jak i FcyRIII, jednoczesne barwienie FcyRII / III przesłaniało regulacyjne działanie rhC5a u myszy WT. Jednakże, analiza cytometrii przepływowej u myszy z mutacją FcyR ujawniła oczekiwane zależne od rhC5a zmiany zwiększonego barwienia FcyRIII w AM z FcyRIIa / p. myszy i zmniejszone barwienie FcyRII w AM z FcyRIII. /. myszy (Figura 5b). Tak więc rhC5a rzeczywiście pełni regulacyjną rolę w modulowaniu równowagi powierzchniowej ekspresji aktywującego FcyRIII i hamującego FcyRII in vivo. Figura 5rhC5a moduluje ekspresję FcyR na AMs in vivo. (a) Komórki BAL-AM wyizolowano z C57BL / 6 WT i C5aRa / | myszy 4 godziny po dotchawicznym podaniu 200 ng rhC5a w 40 .l PBS (czarne słupki, + rhC5a) lub samego PBS (białe słupki, a rhC5a). Analiza TaqMan RT-PCR ujawnia znacząco podwyższony poziom Fc.RIII i obniżone poziomy mRNA FcyRII w BAL-AM od myszy WT, ale nie C5aRa / p. myszy na leczenie rhC5a. Dane są reprezentowane jako średnie. SEM (n = 6 myszy dla każdej grupy, * P <0,05). (b) Komórki BAL-AM (2 x 104) wskazanych myszy wybarwiono przeciwciałem przeciw-Fc anty-FcyRII / III 2,4G2 i analizowano na FACScan (przedstawiono reprezentatywne wyniki dla poszczególnych myszy). Różne wzory barwienia FcyRII / III są specyficznie obserwowane w FcyRIIa / r. i FcyRIII. /. myszy po dotchawiczym wstrzyknięciu rhC5a (linia ciągła, + rhC5a) w porównaniu z PBS (linia przerywana, a rhC5a), wykazując odwrotną regulację ekspresji powierzchniowej AM hamującego FcyRII (zredukowanego) i aktywacji FcyRIII (zwiększonego) przez rhC5a . Lokalne wytwarzanie odwrotnej modulacji FcyRII zależnej od C5a i C5aR w porównaniu z mRNA / białkiem FcyRIII w zapaleniu IC. Aby przetestować hipotezę, że C5a jest indukowane we wczesnym stadium ostrego zapalenia, przeanalizowaliśmy obecność aktywności biologicznej C5a indukowanej przez IC in vivo. BALFy myszy leczonych IC odzyskanych po 2 i 4 godzinach wykazały aktywność chemotaktyczną na PMNs od myszy C57BL / 6, które były silnie zredukowane na PMNs z C5aRa /. myszy (lewy panel na Figurze 6a) i zneutralizowany częściowo in vitro przez mAb anty-C5aR 20/70 (prawy panel na Figurze 6a), który sugerował miejscowe wytwarzanie C5a (oprócz chemokin MIP-2 i KC CXC) ( 28) jest wczesnym zdarzeniem w inicjacji zapalenia IC. Ponadto, stwierdziliśmy, że komórki BAL-AM myszy B6 wykazują zmienioną ekspresję mRNA FcyR w ciągu zaledwie 2 godzin po prowokacji IC (Figura 7). [patrz też: olej z siemienia lnianego, lekarz medycyny pracy wrocław, wypadek przy pracy dokumenty ] [patrz też: wypadek przy pracy dokumenty, tatuowanie gałek ocznych, konwerter jednostek długości ]
