Całkowity RNA przygotowano z komórek BAL-AM wskazanych myszy w 2 godziny po traktowaniu IC / rhC5a przy użyciu odczynnika RNAzol (WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Niemcy). Poziomy ekspresji mRNA FcyR / C5aR znormalizowane do tubuliny oceniano ilościowo za pomocą RT-PCR TaqMan w czasie rzeczywistym, stosując opublikowane startery FcyRII, FcyRIII i a-tubuliny lub następujące startery i sondy swoiste dla FcRc / C5aR: FcR ., sens 5. -ATCTTGTTCTTGCTCCTTTTGGTG-3. i antysensowny 5 (3-GCATCCAGGATATAGCAGAGCTG-3; sonda, 6-FAM-AGCA-GCCGCCCTGGGAGAGC-TAMRA; C5aR, sens 5. – TGT-GGGTGACAGCCTTCGA-3. i antysensowny 5 (3-CCGCCAGA-TTCAGAAACCAG-3; i sondę, 6-FAM-CCAGACGGG-CCGTCAAACGC-TAMRA (21, 37, 38). Analiza funkcjonalna makrofagów pęcherzyków płucnych in vitro. Mysie pęcherzykowe makrofagi MH-S (36) eksprymujące zarówno C5aR jak i FcyR w RT-PCR i analizę FACS utrzymywano w 10% pożywce zawierającej FCS / RPMI 1640 zawierającej suplementy. W doświadczeniach funkcjonalnych, 106 adherentnych komórek MH-S inkubowano przez 24 godziny w sześciu studzienkach do hodowli tkankowej zawierających pożywkę 1% FCS / RPMI 1640 i aktywowano albo 100. G / ml agregowanej cieplnie IgG (mysiej IgG1), jak opisano wcześniej (21). ) lub 50 ng / ml rekombinowanej ludzkiej C5a (Sigma-Aldrich) lub kombinacji obu bodźców. Po różnych punktach czasowych (0, 2, 4, 6, 8 i 16 godzin), odpowiednie rozcieńczenia supernatantów hodowli z nietraktowanych i stymulowanych komórek MH-S badano pod kątem wytwarzania TNF-a. i MIP-2 za pomocą testu ELISA. Całkowity RNA został przygotowany i zanalizowany pod względem ekspresji mRNA C5aR, FcsRI i TNF-a oraz MIP-2 za pomocą RT-PCR TaqMan w czasie rzeczywistym (TNF-a, sens 5. -GTGACCA-GGCTGTCGCTACA-3. I antysensowny 5. – AGGGCAATTAC-AGTCACGGC-3a, sonda, 6-FAM-ACTGAACCTCTGCTCCCCACGGG-TAMRA, MIP-2, sens. 5a-TGTGACGCCCCT-AGGA-3a i antysensowna 5a-TTTGACCGCCCTTGAGAGTG-3 (3, sonda, 6-FAM-CCCACTGCGCCCAGACAGAAGTCA-TA -TAMRA) (39, 40). Analiza statystyczna. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu pakietu statystycznego SPSS V. 9.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Aby przeanalizować różnice w wartościach średnich między grupami, zastosowano dwustronny niesparowany test Studenta. Wyniki Upośledzona reakcja nadwrażliwości płucnej u myszy z mutacją C5aR i FcyRIII. Reakcję nadwrażliwości indukowano przez prowokację OVA: przeciw-OVA IgG IC w płucach myszy C57BL / 6 bez C5aR (C5aRc / a) i FcyRIII (FcyRIIIa / p), a następnie w badaniach kinetycznych przez pomiar MPO tkanki płuc jako marker śródmiąższowego napływu PMN (Figura 1a), przez analizę BALF dla akumulacji PMN w pęcherzykach płucnych (Figura 1b) i przez oznaczenie ilościowe czerwonych krwinek w BALF, wskazując stopień krwotoku płucnego (Figura 1c). Znaczące objawy zapalenia indukowane przez IC ujawniono po raz pierwszy po 4 godzinach, osiągając maksymalne poziomy w 8 do 24 godzin u myszy kontrolnych WT C57BL / 6 dla wszystkich tych parametrów. W Fc. RIII. /. myszy, rekrutacja śródmiąższowych PMN i krwotoków znacznie spadła i była porównywalna do obserwowanej w C5aR. /. zwierzęta po 4 i 8 godzinach, z obniżeniem poziomów tła po 24 godzinach u obu szczepów myszy (Figura 1, a i c). Migracja pęcherzykowego PMN różniła się tym, że atenuacja zmutowanych myszy FcsRIII była znacznie bardziej zmniejszona u myszy zerowych C5aR po 4 godzinach (FcyRIIIa / a vs. C5aR2 / a: 1,61, 0,32 x 105 PMNs vs. 0,92. 0,18 X 105 PMN, n = 7. 19, P <0,05), ale mniej głębokie po 8 godzinach (FcyRIIIa / a vs. C5aRa / a: 6,25 x 2,54 x 105 PMNs wobec 11,54. 1,79 x 105 PMN; n = 7 . 10, P = 0,10) i 24 godziny (FcyRIIIa / a vs. C 5aRa / a: 2,17 x 1,41 x 105 PMN wobec 7,41 a 1,65 x 105 PMNs, n = 7, 9, P <0,05; 0,05) (rysunek 1b). Wyniki te sugerują, że C5aR i FcyRIII są krytycznymi efektorami zapalenia płucnego układu oddechowego i, zgodnie z opublikowanymi danymi (14, 35), mogą wskazywać, że C5aR ma większy udział w początkowych zdarzeniach naciekania neutrofili w patologii płuc indukowanej przez IC. Figura 1Autacja indukowanego przez IC uszkodzenia płuc przez C5aR i niedobór FcyRIII. C57BL / 6 WT (wypełnione koła), FcyRIIIa /. (wypełnione kwadraty) i C5aR. /. (wypełnione trójkąty) myszy otrzymywały dożylnie 150 .g anty-OVA Ab wewnątrz dotchawicznie i 20 mg / kg OVA Ag, a odpowiedź zapalną w płucu pozostawiono na 2 do 24 godzin (IC). Myszy nie otrzymujące OVA Ag służyły jako kontrole Ab (puste kółka). We wskazanych czasach myszy były zabijane i oceniano akumulację PMN w tkance płucnej (a), napływ PMN w przestrzeni pęcherzykowej (b) i krwotok (c). Wyniki są wyrażone jako średnie. SEM (n = 7. 18 myszy dla każdej grupy). Różnice w wylewach krwi do klatki piersiowej oraz w naciekach pęcherzyków płucnych i śródmiąższowych PMN były znaczące (P <0,05) w grupie leczonej IC myszy WT w porównaniu z FcyRIIIa / r. i C5aR. /. myszy po 4, 8 i 24 godzinach. Fc. RIII. /. i C5aR. /. myszy różniły się istotnie tylko w przypadku pęcherzyków płucnych PMN (patrz tekst) [podobne: olej z siemienia lnianego, tatuowanie gałek ocznych, olej z ostropestu właściwości ] [patrz też: anielskie smaki, fundacja dantis, szybkowar czas gotowania ]
