In vivo działanie stymulacji rhC5a i hamowanie C5aR w zapaleniu IC płuc. Biorąc pod uwagę zmniejszony fenotyp zmutowanych myszy C5aR wcześnie, a nie późno w alveolarnej migracji PMN, określiliśmy stymulujące działanie hamowania rhC5a i C5aR w reakcji płucnej Arthus we wczesnych punktach czasowych. Ocena zapalenia płuc po 4 godzinach ujawniła, że miejscowe dotchawiczne podanie rhC5a, które było związane z brakiem objawów zapalenia, gdy podano je same, synergistycznie zwiększa dopływ pęcherzyków PMN, krwotok i wytwarzanie mediatorów MIP-2 i TNF-a. u myszy C57BL / 6 prowokowanych IC (Figura 2). Stwierdzono, że zapalenie IC jest znacząco hamowane przez hamowanie C5aR, powodując zmniejszenie o 70-90% PMN i poziomów czerwonych krwinek (35). IC-indukowana zawartość MIP-2 i TNF-a w BALF myszy C57BL / 6 (2854. 243 pg MIP-2 i 2843. 336 pg TNF-a, n = 13) okazało się być znacząco zmniejszone po zablokowaniu C5aR (1369. 171 pg MIP-2 i 1972. 174 pg TNF-a / BALF; n = 6, P <0,05), jak również u myszy z mutacją C5aR (1540. 535. g MIP-2 i 1478. 269 pg TNF-a, n = 10, P <0,05) lub Fc. Zmutowane myszy RIII (1660. 223 pg MIP-2 i 1463. 269 pg TNF-a, n = 10, P <0,05). Wcześniej wykazano, że AM, ale nie komórki tuczne są głównym komórkowym źródłem MIP-2 / TNF-a wyzwalanym FcyRIII. produkcja in vivo (11, 28). Tak więc, wyniki zależnego od rhC5a wzmocnienia i swoiste dla C5aR hamowanie wytwarzania cytokin i nacieki neutrofilów sugerują związek między C5a / C5aR i FcyRIII w aktywacji AMs w zapalnym zapaleniu IC. Figura 2 Zapalenie płucne płuc u myszy otrzymujących rhC5a. Indukcję odpowiedzi zapalnej w płucu przeprowadzono przez dotchawiczne podanie 150 .g oczyszczonego przeciwciała anty-OVA Ab, a następnie systemowego 20 mg / kg OVA Ag u myszy C57BL / 6 typu dzikiego (IC) lub myszy WT traktowanych rhC5a (IC + rhC5a). Myszy otrzymujące tylko Ab lub rhC5a służyły jako kontrole (Ab, rhC5a). Po 4 godzinach płuca płukano i badano BALF pod kątem infiltracji PMN (górne lewe), krwotoku płucnego (górny prawy róg) i wytwarzania MIP-2 i TNF-a. (dolne panele). Dane są wyrażone jako średnie. SEM (n = 6. 13 myszy dla każdej grupy). Różnice w IC w porównaniu z grupami ICs + rhC5a były istotne dla wszystkich parametrów (* P <0,05, ** P <0,001). Koekspresja C5aR i FcyRIII na makrofagach pęcherzykowych in vitro i in vivo. Badania in vivo AM wykazały istotną rolę tych komórek efektorowych w różnych modelach patologii płuc (41. 43). Tak więc, zbadaliśmy poziomy ekspresji C5aR i FcyR w świeżo izolowanych AM i hodowanych in vitro AM MH-S (36). Do pomiaru białka C5aR użyto szczurzego mAb anty-mysiego C5aR 20/70. Swoistość C5aR mAb 20/70 została potwierdzona za pomocą analizy cytometrii przepływowej wykazującej pozytywne barwienie PBC i AM z myszy C57BL / 6 WT, ale nie myszy z mutacją C5aR (Figura 3a). Połączona inkubacja 20/70 i 2,4 G2 (która rozpoznaje wspólny epitop na mAb FcyRII i FcyRIII) wykazała dwukrotne pozytywne barwienie AM od normalnych myszy (Figura 3a) lub MH-S AM (Figura 3b), co sugerowało, że pęcherzykowe makrofagi koekstrują FcyRII / III i C5aR na swoich powierzchniach. Figura 3Ciągowe wykrywanie cytometryczne C5aR i FcyRII / III na AM. (a) Komórki kontrolne z krwi obwodowej (PBC) i rezydentnych AM izolowanych z płynu BAL z C57BL / 6 WT i C5aRa /. myszy barwiono nowo opracowanym mAb anty-C5aR 20/70 skoniugowanym z FITC w połączeniu z mAb przeciw PE anty-FcyRII / III 2.4G2 i analizowano na FACScan. (b) Komórki AM MH-S hodowano w warunkach 10% FCS w środowisku. Jednoczesną ekspresję FcyRII / III i C5aR wykrywano za pomocą analizy FACS przy użyciu mAb PE-2.4G2 i FITC-20/70. rhC5a synergistycznie zwiększa zależną od FcyRIII aktywację AM in vitro. Badania na szczurach badających rolę dopełniacza w uszkodzeniu płuc wykazały, że C5a synergistycznie wzmacnia wytwarzanie chemokin AM wywołane chemokinami in vitro i in vivo (44). Aby zbadać molekularną podstawę zwiększonej aktywacji IC przez C5a, najpierw zbadaliśmy, czy rhC5a ma bezpośredni wpływ na ekspresję FcyRs na makrofagach. W komórkach MH-S AM, 2-godzinna inkubacja z 50 ng / ml rhC5a była związana ze znaczącą redukcją mRNA FcyRII i silnie zwiększoną ekspresją FcyRIII (Figura 4a), ale nie zmieniała poziomów C5aR (dane nie przedstawione) . Następnie określiliśmy, czy zależny od C5a wzrost stosunku mRNA FcyRIII / FcyRII przyczynia się do zwiększonej aktywacji komórek MH-S. Stymulacje samym rhC5a nie były wystarczające do pośredniczenia w indukowanej syntezie TNF-a i MIP-2 [patrz też: tatuowanie gałek ocznych, astra wrocław godziny otwarcia, mycie włosów szarym mydłem ] [więcej w: fundacje lublin, jako synonim, mycie włosów szarym mydłem ]
