Cztery dni po iniekcji oocyty utrwalano 3% paraformaldehydem (Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy) w PBS przez 4 godziny w temperaturze 4 ° C. Do immunochemii użyto zestawu do amplifikacji sygnałów tyramidowych (TSA-Direct, NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA). Krioskrawki (o grubości 6. M) inkubowano przez godzinę z rozcieńczonym 1: 100 przeciwciałem anty-FLAG IgG (Kodak). Po płukankach inkubowano je przez godzinę z rozcieńczeniem 1: 100 sprzężonej z peroksydazą chrzanową owczej anty-mysiej immunoglobuliny (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja), następnie ujawniano przez inkubację przez 10 minut z dostarczonym tyrozydem fluoresceiny. koniugaty rozcieńczone 1:50. W celu znakowania cytoszkieletu F-aktyny błony komórkowej oocytu, do buforu amplifikacyjnego dodano rozcieńczenie 1:50 związanej z rodaminą falloidyny (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Skrawki zostały zamontowane za pomocą DAKO-Glycergel (DAKO Corp., Glostrup, Dania) zawierającego 2,5% 1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktanu jako opóźniacza zaniku (Sigma Chemical Co., Buchs, Szwajcaria) i badano przez epifluorescencję z mikroskopem Polyvar (Reichert-Jung, Wiedeń, Austria). Zdigitalizowane obrazy zostały pozyskane za pomocą kamery VISICAM CCD (Visitron, Puchheim, Niemcy) i przetworzone przez oprogramowanie Image-Pro Plus (wersja 3.0, Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Dla każdego oocytu użyto identycznych ustawień. Wyniki Szczurze i ludzkie mutacje typu stop ENAC umożliwiają znaczącą ekspresję aktywnych kanałów. Mutacja stop (R508stop) stwierdzona u pacjentów z PHA-I przerywa 46 aminokwasów białka ENaC przed przewidywaną a-helisą drugiej domeny transbłonowej (M2), usuwając tę domenę, domenę poprzedzającą M2 (pre-M2) i wewnątrzkomórkowy koniec COOH. Zachowuje jednak dużą część pętli pozakomórkowej i 2 skrzynki bogate w cysteinę, charakterystyczne dla nadrodziny genu ENaC (14) (rysunek 1). Wprowadziliśmy mutację stop w podjednostce szczurzy. ENaC w równoważnej pozostałości (. L535stop) i poddajemy ją koekspresji. i . szczur ENaC. Przy pomiarze metodą 2-elektrodowej napięciowo-zaciskowej, odtwarzalne czułe na amiloryd prądy zapisywano z oocytów. L535stop ., które wstrzyknięto, osiągając 13% prądów zmierzonych w. Oocytach wstrzykniętych 4 dni po wstrzyknięciu (Figura 2, a. .do). Prądy te były znacznie wyższe niż te zarejestrowane w oocytach, którym wstrzyknięto. podjednostki (P <0,001 w dniach 3 i 4 po wstrzyknięciu) lub wodą (P <0,001 w dniach 3. 6) (Figura 2b). Trzy różne kinetyki pojawiania się makroskopowego wrażliwego na amiloryd prądu Na + można było zaobserwować w okresie po wtrysku (Figura 2, aib). (a) W . Oocyty wstrzyknięte przez rENaC, prądy wrażliwe na amiloryd były już wykrywalne po kilku godzinach i osiągnęły szczyt w drugim dniu po wstrzyknięciu. (b) Oocyty wstrzyknięte. L535stop. wykazują wolniejszą kinetykę, osiągając szczyt po 4 dniach. (c) Nieoczekiwanie, wrażliwe na amiloryd prądy rejestrowano z oocytów, którym wstrzyknięto. rENaC (między 0,5 a 2 A) 6 dni po wstrzyknięciu (znacznie wyższe niż oocyty z iniekcją wody; P <0,001). Ich maksymalna ekspresja została zarejestrowana w siódmym dniu. Rysunek 1. Skrócone podjednostki ENaC odnotowano w recesywnym PHA-I. Pierwotna struktura typu dzikiego (WT) i przewidywane delecje. podjednostki są zilustrowane. M1 i M2 oznaczają pierwszą i drugą domenę transbłonową; P oznacza domenę pre-M2 drugiej domeny transbłonowej. CRB1 i CRB2 oznaczają pudełka i 2 bogate w cysteinę. Obydwie mutacje delecji zgłoszone dla pacjentów z PHA-I (ludzki R508stop i ludzki AI68fr) przewidują przerwanie. podjednostki przed domenami M2 i M1 obejmującymi błonę. Figura 2 (a) Przebiegi czasowe makroskopowego prądu czułego na amiloryd typu dzikiego, L535stop i Oocyty wstrzyknięte przez szczurze ENaCa. Oocytom wstrzyknięto 3 ng cRNA każdej szczurzej podjednostki ENaC w następujący sposób:. (wypełnione trójkąty),. L535stop. (wypełnione kwadraty) lub. (otwarte kółka). Wrażliwy na amiloryd (100 .M) prąd Na + oznaczano codziennie w roztworze kąpielowym zawierającym 120 mM NaCl. Oocyty zaciśnięto przy ~ 100 mV i zmierzono metodą 2-elektrodowego docisku napięcia. Prądy są podawane jako średnia. SEM otrzymany z 17. 34 oocytów (6 niezależnych eksperymentów). * P <0,001, . kanały kontra mutant. L535stop lub. kanały. (b) Skupić się na zmutowanym. L535stop. (wypełnione kwadraty) - makroskopowe bieżące przebiegi czasowe w porównaniu z cewkami wstrzykniętymi (z otwartym krążeniem) i oocytami z otwartym wtryskiem wody (otwarte trójkąty). * P <0,001, zmutowany. L535stop. względem. - lub oocytów wstrzykniętych przez wodę [przypisy: mycie włosów szarym mydłem, badanie kału na pasożyty, lekarz medycyny pracy wrocław ] [więcej w: ciąża miesiąc po miesiącu, zus dobrowolne ubezpieczenie zdrowotne, powiększone serce przyczyny ]
