Q79R SHP2 wytworzono z cDNA WT SHP2 przy użyciu mutagenezy opartej na PCR. Następnie, WT i Q79R SHP2 umieszczono w promotorach a- i P-MHC i wygenerowano myszy Tg. Sekwencje PCR stosowane do genotypowania były następujące: sens 5 (3-GGTCATGCGTGTTAGGAAC-3 (3, antysensowny 5 (3 -TTGTCTGGTCCACCAAGGAATAC-3 .. Wszystkie linie Tg i myszy ukierunkowane na geny wykonywano w lub krzyżowano wstecznie na tle FVBN przez co najmniej 7 pokoleń przed zastosowaniem w analizowanych krzyżówkach. Histologia i immunohistochemia. Wszystkie serca używane do histochemii utrwalono w stanie odprężonym przez wlew 4% formaldehydu w buforze kardioplegowym (50 mM KCl w 5% dekstrozie) z prawego przedsionka, podczas gdy serce nadal biło. Następnie serca utrwalono 4% paraformaldehydem w PBS przez noc, zatopiono w parafinie, podzielono na 5. M grubości i wybarwiono H & E i trichromem Massona. Zastosowane skrawki analizowano według ścisłych kryteriów diagnostycznych: obecność defektów przegrody międzyprzedsionkowej / VSD określono tylko w sekcjach, w których przegrody między przedsionkiem, przegrody międzykomorowej i podstawy mięśnia sercowego obu komór były obecne w jednej płaszczyźnie. Sekcje używane do ilościowego oznaczania niekomoracji komór były we wszystkich przypadkach dokładnie w środkowej części serca, gdzie obszary jamy prawej i lewej komory były największe, a wszystkie ulotki zarówno zastawki mitralnej, jak i zastawki trójdzielnej były widoczne w tej samej płaszczyźnie. Te kryteria cięcia zapobiegły wszelkim artefaktom, które mogą wynikać z ukośnego kąta cięcia. Kryteria diagnostyczne odpowiadają widokowi komory płucnej. stosowany podczas USG klinicznego. Wszystkie serca były całkowicie i kolejno dzielone (grubość 5. M): co najmniej 4 serca dla każdej linii podzielono w ten sposób i podzielono 3 sekcje dla każdego serca. Korzystając z tych przekrojów, wyznaczono całą wolną ścianę lewej i prawej komory przy użyciu MetaMorph (wersja 6.3, Molecular Devices). Wyrysowano prostokąt obejmujący całą wolną ścianę i określono liczbę pikseli w mięśniu sercowym (pomarańczowym, fig. 4C). Wskaźnik zagęszczenia został następnie zdefiniowany jako obszar pomarańczowego regionu podzielony przez obszar obszaru zainteresowania. Korzystając z tej metody, uzyskaliśmy wysoce powtarzalne wyniki w porównaniach serc z tej samej grupy. Serce zostało zdefiniowane jako nieskomplikowane, jeśli wartość jego wskaźnika spadła o 2 SD poniżej wskaźnika uzyskanego z co najmniej 5 Ntg serc w tym samym wieku. W przypadku immunohistochemii, zarodkowe serca utrwalono przez noc w 4% paraformaldehydzie w PBS w 0 ° C i zatopiono w OCT, jak opisano wcześniej (64), a wycinki 5. M wycięto z zamrożonego bloku. Użyto pierwotnych przeciwciał: (a) kozie anty-SH-PTP2 (rozcieńczenie E-20; 1: 100; Santa Cruz Biotechnology Inc.) w celu identyfikacji SHP2; (b) króliczą anty-rozszczepioną kaspazę-3 (rozcieńczenie 1: 100, technologia sygnalizacji komórkowej); (c) królicze anty-Ki-67 (rozcieńczenie 1: 1000, Abcam) w celu zbadania proliferacji kardiomiocytów. Osioł przeciw osiołom Alexa Fluor 488 lub kozie anty-królika Alexa Fluor 568 (rozcieńczenie 1: 100, Molecular Probes, Invitrogen) zastosowano jako przeciwciało drugorzędowe. Jądra barwiono TO-PRO-3 (rozcieńczenie 1: 200, Molecular Probes, Invitrogen) przez 20 minut. Analiza białek. Ekstrakty białkowe przygotowano z homogenatów mięśnia sercowego pochodzących z 5 zarodkowych serc 5 (przy E16.5) i 20 (przy E9.5). Próbki komorowe homogenizowano na lodzie w buforze RIPA z 1% koktajlem inhibitora fosfatazy (Sigma-Aldrich). Homogenaty odwirowano (8000 gw ciągu 10 minut w 4 ° C), a supernatant zmieszano z buforem ładującym SDS-PAGE, a następnie zagotowano i odwirowano. Zastosowano następujące przeciwciała: SH-PTP2 (C-18), MYPT1 (rozcieńczenie 1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), p44 / 42 MAPK, fosfo p44 / 42 MAPK, p38, fosfo-p38, JNK1 / 2. fosfo-JNK1 / 2, ERK5, fosfo-ERK5, Akt, Ser473-fosfo-Akt, STAT1, fosfo-STAT1, STAT3, fosfo-STAT3, fosfo-STAT5, kaspaza-3 (rozcieńczenie 1: 1000, technologia sygnalizacji komórkowej) fosfo-MYPT1 i STAT5B (rozcieńczenie 1: 3000, Upstate, Millipore) i GAPDH (rozcieńczenie 1: 300, Chemicon, Millipore). Wiązanie pierwotnego przeciwciała wizualizowano przez wtórne przeciwciała skoniugowane z HRP i wzmocnioną chemiluminescencję (Amersham, GE Healthcare). Niefosforylowane i ufosforylowane gatunki wizualizowano i oceniono ilościowo w Storm PhosphorImager (Molecular Devices, GE Healthcare Life Sciences). RT-PCR. Trzy mikrogramy RNA poddano reakcji RT, a otrzymany cDNA uzyskano przy użyciu SuperScript III (Invitrogen), jak opisano poprzednio (64). Analizę PCR znaczników różnicowania przeprowadzono przy użyciu ich swoistych starterów
[podobne: miód gryczany zastosowanie, szybkowar czas gotowania, konwerter jednostek długości ]
[patrz też: konwerter jednostek długości, olej z ostropestu właściwości, słód jęczmienny gdzie kupić ]
