Aby zbadać efekt wzmocnienia funkcji mutacji NS SHP2 na sercu, wygenerowaliśmy myszy Tg, w których normalna, WT i zmutowana SHP2 była eksprymowana specyficznie w kardiomiocytach, zarówno podczas ciąży, jak i po urodzeniu. Do tego badania wykorzystano najczęściej występującą mutację w domenie N-SH2 SHP2, Q79R (17), która ma 4,5-krotnie wyższą aktywność fosfatazy niż WT SHP2 (19). The i promotory ciężkiego łańcucha miozyny (a-MHC i y-MHC) zastosowano do ekspresji WT i Q79R SHP2 odpowiednio w komórkach płodu i po urodzeniu (Figura 1, A i B). Utworzono wiele linii (dodatkowa postać 1, materiał dodatkowy dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI30756DS1), a po określeniu poziomów ekspresji dla każdego konstruktu Tg wyselekcjonowaliśmy pojedyncze linie myszy pokazujące w przybliżeniu równoważne wzrosty w białku SHP2 serca. treść do kolejnych analiz (rysunek 1C). Aby potwierdzić rozwojową segregację promotorów. to jest bezczynność promotora a-MHC podczas rozwoju komorowego. całkowite białko SHP2 zmierzono od E9,5 do E16.5 w linii a-MHC Q79R przedstawionej na Figurze 1C. Zgodnie z oczekiwaniami poziomy białka SHP2 nie różniły się pomiędzy nietransgenicznymi (Ntg) i Tg zwierzętami (Figura 1D). Figura Specyficzna transgenu ekspresja transgenu w prawidłowym lub zmutowanym SHP2 w komorach. (A) Schemat ideowy Ptpn11 przedstawiający przybliżone granice egzonów dla domen funkcjonalnych i lokalizacji mutacji Q79R. (B) Konstrukty stosowane do generowania specyficznej dla kardiomiocytów ekspresji zmutowanego białka Q79R normalnego (WT) lub NS. Mysie cDNA zawierające normalny (WT) lub zmutowany (Q79R) SHP2 był połączony z promotorem P lub P-MHC w celu ekspresji transgenu. Promotor a-MHC eksprymuje transgen w kardiomiocytach komorowych pomiędzy E9.25 i E19, podczas gdy promotor a-MHC eksprymuje transgen w komorze poporodowej. Pionowe pola w promotorach a-MHC i a-MHC reprezentują egzoni niekodujących w regionie 5. Nie tłumaczonym. Sekwencję sygnałową poli-adenylowania pochodzącą z ludzkiego genu hormonu wzrostu (hGH) wstawiono poniżej cDNA. (C) Analiza Western blot tkanki serca Tg. W sercach a-MHC ekspresja białka SHP2 była zwiększona 5,3-krotnie w obu sercach WT i Q79R Tg przy E16.5. Ekspresja białka SHP2 była zwiększona odpowiednio 11,4 i 13,6 razy w sercach P-MHC WT i Q79R w 3 miesiące po urodzeniu. (D) Aby potwierdzić, że konstrukt SHP2 kierowany przez | 3-MHC2 był transkrypcyjnie nieaktywny podczas ciąży, całkowite białko SHP2 w linii Q79R (13,6-krotna nadekspresja po urodzeniu) mierzono przy E9,5 . E16.5, okres, podczas którego zagęszczanie występuje. Gdy wartości zostały znormalizowane do kontroli obciążenia GAPDH, nie zaobserwowano statystycznie istotnego wzrostu poziomów białka. W E16.5, niekomuracja komorowa, ubytki przegrody międzykomorowej (VSD) i anormalna anatomia rowka międzykomorowego były widoczne w sercach P-MHC Q79R, fenotyp podobny do tego opisanego w innym modelu myszy NS, w którym D61G SHP2 mutacja została wyrażona (18). Gdy przeanalizowano wiele linii wykazujących różne poziomy nadekspresji, nasilenie i częstość defektów zależały od dawki (Suplement 1). Przeciwnie, serca a-MHC WT, a-MHC Q79R i a-MHC WT nie wykazywały zaburzonej architektury komorowej (Figura 2A). Histologia serca po 3 miesiącach wykazała, że znacząca nadekspresja SHP2 w kardiomiocytach po urodzeniu nie wywierała wpływu ani na sercach P-MHC WT ani Q79R. W sercach a-MHC Q79R, nieurodzajowy zarodek komorowy utrzymywał się po urodzeniu (Figura 2B), bez śladów zwłóknienia (Figura 2C). Rycina 2 Wyniki histologiczne. (A) Czterokomorowy widok serc w E16.5 (oryginalne powiększenie, × 4). Niewypełnienie komorowe, VSD (groty strzałek) i nieprawidłowa anatomia rowka międzykomorowego (*) są widoczne w sercach P-MHC Q79R, podczas gdy serpentyny a-MHC WT i Q79R i A-MHC WT wydają się być normalne. (B) Wzdłużne sekcje komorowe w 3 miesiące po urodzeniu, wybarwione H & E (oryginalne powiększenie, x 4). Każdy obraz przedstawia wolną ścianę prawej komory po lewej stronie i przegrodę komorową po prawej stronie. Pomimo nadekspresji SHP2 w kardiomiocytach poporodowych, nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowości w sercach P-MHC WT i Q79R. W sercach P-MHC Q79R niekomórki komór obserwowane w stadium embrionalnym nadal występowały po urodzeniu. (C) Barwienie trichromem w masońskim woluminie prawej komory z prostokątnego obszaru wskazanego w B (oryginalne powiększenie, × 10)
[przypisy: miód gryczany zastosowanie, fundacja dantis, tatuowanie gałek ocznych ]
[podobne: dokumenty synonim, sanatorium nad morzem dla dzieci, wskazuje synonim ]
