Po odbarwieniu 30% metanolem, przesunięty w górę pasek wycięto i poddano proteolitycznemu trawieniu w welu za pomocą trypsyny. Jako kontrolę prążek 150 kDa odpowiadający nieskompleksowanemu mAb 5-1-6 został wycięty i przetworzony podobnie. Zarówno pasma kontrolne, jak i przesunięte w górę były analizowane przez MS (przez TA Addona i KB Charron). Zgodnie z oczekiwaniami zidentyfikowano kilka peptydów IgG w kompleksie o wielkości 300 kDa. Ponadto zidentyfikowano pojedynczy peptyd o długości 10 aminokwasów (LDVHYAPTIR) o pełnej identyczności z sekwencją w zewnątrzkomórkowej domenie opublikowanej sekwencji ludzkiej nefryny (Figura 2). Na koniec zidentyfikowano pojedynczy peptyd o homologii z szczurzym aktyną w kompleksie o wielkości 300 kDa. Analizowano wszystkie widma MS / MS i nie zidentyfikowano żadnych innych istotnych sekwencji białkowych. W szczególności, sekwencja nefryny była jedynym obecnym transbłonowym białkiem. Tylko sekwencje IgG uzyskano z pasma 150 kDa mAb 5-1-6. Figura 2Schematyczne przedstawienie nefryny wykazujące pochodzenie sekwencji peptydowych zidentyfikowanych przez MS / MS w immunoprecypitatach glomeruli szczura. Sekwencję powyżej nefryny uzyskano z usieciowanego immunoprecypitatu, a 2 poniżej zidentyfikowano z plamy żelu 2D o masie cząsteczkowej 185 kDa. Odpowiednią sekwencję ludzką zaznaczono kursywą. Strzałka uwydatnia niedopasowanie pojedynczego aminokwasu między sekwencją pochodną MS / MSa a sekwencją ludzką. W schemacie nefryny, ponumerowane czarne regiony wskazują domeny Ig-podobne; FN, domena podobna do fibronektyny typu III; M, domena transbłonowa; i C, domena cytoplazmatyczna. W celu specyficznego wyizolowania białka będącego przedmiotem zainteresowania i uproszczenia analizy MS / MS, rozdzieliliśmy immunoprecypitat mAb 5-1-6 za pomocą elektroforezy żelowej 2D. W warunkach redukujących DTSSP ulega rozszczepieniu, a kompleks ulega dysocjacji na poszczególne składniki. Figura 3 pokazuje wybarwiony srebrem żel 2D immunoprecypitatu mAb 5-1-6 z jego kontrolą dla porównania. Plamka jest wyraźnie widoczna tuż poniżej markera 220 kDa z pI 4,95 . 5,2 w żelu 5b do mAb 5b. Żadne inne swoiście zabarwione obszary nie zostały zidentyfikowane w żelu 5b mAb 5. I żadne równoważne miejsce nie było obecne w żelu kontrolnym. Identyczny, ale słabszy punkt obserwowano przy 185 kDa w niebieskim żelu Coomassie z drugiego eksperymentu (nie pokazano). Plamkę o masie 185 kDa wycięto z wybarwionego srebrem żelu, wraz z odpowiednim obszarem z żelu kontrolnego i analizowano za pomocą LC-MS / MS po wszczepieniu proteolitycznym w żelu trypsyną. Dwa peptydy zidentyfikowano poprzez dopasowanie bazy danych z pasma żelu 185 kDa. Jeden peptyd miał 100% identyczności sekwencji z ludzką nefryną (VAAAGDSTSSATLHCR). Zaobserwowano, że drugi peptyd wykazuje silną homologię z inną sekwencją ludzkiej nefryny (H7toN: FAPQVENPTPLTK). Oba peptydy zidentyfikowano poprzez przeszukiwanie bazy danych widm MS / MS za pomocą MS-Tag w trybach identyczności i homologii (Figura 2). Rycina 3 Dwuwymiarowe żele zabarwione srebrem. Izolowany kłębuszek Sprague-Dawley inkubowano z mAb 5-1-6 lub RVG-1. Po przemyciu kompleks przeciwciało / antygen sieciowano DTSSP, a następnie rozpuszczono w detergencie i immunoprecypitowano kozim anty-mysim IgG związanym z agarozą. Osady zostały następnie rozdzielone przez elektroforezę żelową 2D w warunkach redukujących, a żele zabarwiono srebrem. Rejestrowano pH żelu elektroogniskowego, a wartości przedstawiono poniżej dolnego żelu. Mniejsze groty wskazują na wewnętrzną kontrolę tropomyozyny (pI 5,2; 33 000 kDa). Duża strzałka wskazuje plamkę o masie cząsteczkowej 185 kDa, pI 4,95 A 5.2, która jest specyficznie immunoprecypitowana przez mAb 5-1-6. Duży anionowy zabarwiony srebrem plamka poniżej markera 29 kDa reprezentuje łańcuch lekki IgG, a seria kationowych plamek poniżej markera 60 kDa to ciężki łańcuch IgG zarówno w mAb 5-1-6 jak i kontrolnym. Western blotting immunoprecypitatu mAb 5-1-6 z króliczym przeciwciałem przeciw paraliżowi. Ekstrakt kłębuszkowy Triton X-100 poddano immunoprecypitacji za pomocą mAb 5-1-6 lub RVG-1, a uzyskany osad rozdzielono przez SDS-PAGE w warunkach redukujących. Figura 4 pokazuje wyniki Western blot tego preparatu z przeciwciałem poliklonalnym antynefryny. To przeciwciało zostało podniesione przeciwko domenie cytoplazmatycznej mysiej nefryny, ale także identyfikuje ludzką i szczurzy nefrynę. Specyficzne pasmo było obecne przy 185 kDa w ścieżce mAb 5-1-6 (Figura 4a). Immunoprecypitacja kontrolnym mAb RVG-1 była ujemna (Figura 4a). Ponadto, analiza Western blot ekstraktu kłębuszkowego ujawniła dublet prążków nefryny, które zostały częściowo zubożone po immunoprecypitacji z mAb 5-1-6 (Figura 4b)
[patrz też: słód jęczmienny gdzie kupić, fundacja dantis, astra wrocław godziny otwarcia ]
[patrz też: miód gryczany zastosowanie, mycie włosów szarym mydłem, wypadek przy pracy dokumenty ]
