Immunoblot z nie- odporną surowicą króliczą był ujemny. Reprezentatywna analiza Western blot nefryny w sieciowaniu nie-sieciowanym mAb 5-1-6 i immunoprecypitacji RVG-1. (a) Ekstrakt kłębuszkowy Triton X-100 inkubowano z mAb 5-1-6 lub RVG-1, a następnie z agarozą białkową G. Przemyte peletki rozpuszczono w redukującym buforze do próbek i rozdzielono przez 7,5% SDS-PAGE. Po elektroblottingu do nitrocelulozy membranę inkubowano z króliczą antynocefryną (1: 1000), a następnie skoniugowaną z HRP kozią anty-króliczą IgG (1: 2000). Reaktywne białka wykrywano przy użyciu techniki chemiluminescencyjnej. Specyficzne białko reaktywne w stosunku do antypineiny o masie cząsteczkowej 185 kDa jest obecne w szlaku precypitacyjnym mAb 5-1-6 i jest nieobecne na ścieżce kontrolnej. (b) Ekstrakt kłębuszkowy Triton X-100 inkubowano z mAb 5-1-6, a następnie z agarozą białkową G. Przemyty osad został rozpuszczony w redukującym buforze do próbek i rozdzielony przez 5% SDS-PAGE wraz z równymi próbkami (10. L / ścieżkę) z ekstraktu kłębuszkowego przed i po mAb 5-1-6 IP. Po elektroblotingu do nitrocelulozy błonę inkubowano z króliczą anty-nefryną (1: 1000) lub normalną króliczą Ig (1: 1000), a następnie skoniugowaną z HRP kozią anty-króliczą IgG (1: 5000). Reaktywne białka wykrywano za pomocą chemiluminescencji (ekspozycja na antynadynę: 1- do 2-sekundowej, normalna ekspozycja królika Ig: 30-sekundowa ekspozycja). Oprócz pasma 185 kDa w szlaku precypitacyjnym mAb 5-1-6, w pasmach ekstraktu kłębuszkowego występuje częściowe zubożenie nefryny z drogi poresekcyjnej (densytometria górnego prążka przed pokwitaniem: 174 Y 20,9 względem 137. 24,0, n = 5, średnia . SEM, P <0,02, test t dla pary). Immunohistologiczne porównanie dystrybucji kłębuszkowej antygenu 5-1-6 nefryny i mAb. Jak wcześniej podano, barwienie normalnej nerki mAb 5-1-6 dało zbieżny ziarnisty wzór barwienia obwodowych kłębuszkowych pętli kapilarnych (Figura 5). Antynafryna dawała identyczny wzór barwienia. Nakładanie czerwonych i zielonych obrazów fluorescencyjnych podwójnie zabarwionych sekcji potwierdziło to wrażenie. Figura 5. Kolokalizacja antygenu 5-1-6 nefryny i mAb. Dwufazowa immunofluorescencja z mAb 5-1-6 (czerwony) i króliczym przeciwciałem przeciw nefrynie (zielona) w 4. M krioskrawkach z normalnej nerki szczura Wistar. Identyczna lokalizacja nefryny i antygenu 5-1-6 mAb w prawidłowej nerce wynika z żółtego zabarwienia na złożonym obrazie reprezentującym nałożenie się 2 fluoropubułek. Powiększenie, × 400. Dyskusja Wyniki te dokumentują, że antygen zidentyfikowany przez mAb 5-1-6 jest nefryną szczura. Ustanawiają również nefrynę jako integralny składnik przepony szczelinowej podocytu i potencjalny cel urazu w nabytych, a także dziedzicznych postaciach białkowych chorób nerek. Ponadto, wyniki dostarczają nowych informacji na temat natury nefryny i możliwych wglądów w jej rolę w regulacji permerelektywności kłębuszkowej. Szczelina przepona jest uważana przez wielu za główną barierę strukturalną dla wycieku makrocząsteczek w kłębuszku. Jego struktura i skład molekularny pozostają jednak niepełne. Analiza mikroskopowa wczesnego mikroskopu elektronowego glicerolu utrwalonego w kwasie garbnikowo-glutarowym ujawniła wysoce uporządkowaną, izoporową strukturę szczelinowo-przepony, z konfiguracją drabinkową lub zamkową (15, 16). Ostatnio szybkie mrożenie preparatu z nieutrwalonej tkanki ujawniło nieporowatą podstrukturę z węższymi szczelinami filtracyjnymi niż te widoczne przy nieruchomej tkance, co sugeruje, że uprzednio zidentyfikowane pory w szczelinowo-przeponowej były po prostu artefaktem utrwalającym wynikającym z kurczenia się i cofania stopy. procesy (17, 18). Do niedawna jedynym potwierdzonym białkiem związanym z przeponą szczelinową było ZO-1 (6). Jest to białko o masie 210 kDa, które znajduje się na powierzchni cytoplazmatycznej szczeliny szczelinowej. W ubiegłym roku, w wyniku badania pacjentów z wrodzonym zespołem nerczycowym typu fińskiego, gen dla nefryny został sklonowany (4). Nefryna jest białkiem aminokwasu 1,241. Z dużą przypuszczalną domeną zewnątrzkomórkową, która zawiera 8 modułów podobnych do immunoglobulin i moduł podobny do fibronektyny typu III. Krótka domena wewnątrzkomórkowa nie ma homologii z innymi znanymi białkami, ale zawiera 9 reszt tyrozyny, które potencjalnie mogą być fosforylowane, co sugeruje możliwą rolę w sygnalizacji komórkowej. Na podstawie tych danych zasugerowano, że nefryna funkcjonuje jako receptor adhezji komórkowej, chociaż nie uzyskano jeszcze danych potwierdzających ten fakt. Jeśli chodzi o lokalizację nefryny, analiza Northern blot ujawniła specyficzną dla nerki dystrybucję, a hybrydyzacja in situ wykazała, że nefryn jest wyrażany wyłącznie w trzewiowych komórkach nabłonka kłębuszkowego (4) [przypisy: fundacja dantis, konwerter jednostek długości, centrum medyczne białystok ] [podobne: tatuowanie gałek ocznych, konwerter jednostek długości, olej z ostropestu właściwości ]
