W opisywanych tu badaniach wykazaliśmy, że reaktywne monoklonalne mAb 5-1-6 reaktywne wobec przepony szczelinowej identyfikuje zewnątrzkomórkową domenę nefryny, tym samym dokumentując znaczenie szczelinowo-przepony i jej składnika, nefryny, w regulacji permerelektywności kłębuszkowej . Metody Przeciwciała. Płyn puchlinowy zawierający mAb 5-1-6 wytworzono u myszy otrzymujących primant 2,6,10,14-tetrametylopentadekanu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) i wstrzyknięto dootrzewnowo mysią hybrydomę IgG1 przygotowaną jak opisano wcześniej. (1). Ten płyn poddano 50% wytrącaniu siarczanem amonu, a frakcję bogatą w immunoglobulinę dializowano wobec PBS (0,9% NaCl w 10 mM buforze fosforanu sodu [pH 7,4]) przez 2 dni i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Nieistotne mysie monoklonalne przeciwciało IgG1, RVG-1, traktowano w ten sam sposób i stosowano jako kontrolę. Przeciwciało królika do pełnej domeny cytoplazmatycznej mysiej nefryny zostało podniesione przez immunizację królików peptydem znakowanym heksahistydyną, wyrażonym w transformowanej Escherichia coli (11). Fragment cDNA mysiej nefryny kodujący końcowe aminokwasy COOH 155 amplifikowano za pomocą PCR, sklonowano kierunkowo do bakteryjnego wektora ekspresyjnego pRSETA (Invitrogen Corp., San Diego, California, USA) i transfekowano do E. coli. Wyrażone białko fuzyjne oczyszczono z zlizowanych bakterii na kolumnie z niklem i agarozą i zastosowano do immunizacji królików przez wstrzyknięcie domięśniowe. 50% precypitat siarczanu amonu wytworzono z surowicy odpornościowej po trzeciej immunizacji i dializowano wobec PBS przed użyciem w tych badaniach. Badania Western blotting wykazały, że ta antyserum specyficznie identyfikuje białko o masie cząsteczkowej 185 kDa w ekstraktach kłębuszkowych myszy, szczura i człowieka, a w mikroskopii immunoelektronowej lokalizuje się na bocznych powierzchniach procesów podocytów w szczelinach filtracyjnych (11). Jako kontrolę zastosowano normalną surowicę króliczą. Sprzężone z CY3 osiołowe anty-mysie IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania, USA) i skoniugowane z FITC kozie anty-królicze IgG (Sigma Chemical Co.) zostały użyte do mikroskopii immunofluorescencyjnej, a kojarzona z peroksydazą chrzanową (HRP). anty-mysie IgG (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, Alabama, USA) i skoniugowane z HRP kozie anty-królicze IgG (Sigma Chemical Co.) zastosowano do analizy Western blotting. Zwierząt. Normalne dorosłe szczury Wistar ważące 150 - 175 g zakupiono od Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). W celu izolacji kłębuszków na dużą skalę zamrożone nerki Sprague-Dawley zakupiono od Pel Freez (Rogers, Arkansas, USA). Materiały. Wszystkie materiały zakupiono od Sigma Chemical Co., o ile nie zaznaczono inaczej. Przygotowanie materiału do sekwencjonowania białka i 2-wymiarowej elektroforezy żelowej. Identyfikacja antygenu 5-1-6 mAb była utrudniona przez brak reaktywności w analizie Western blot. Ponadto wstępne badania wykazały, że konwencjonalna immunoprecypitacja ekstraktów kłębuszkowych z mAb 5-1-6 nie dawałaby wystarczającej ilości materiału do analizy sekwencji peptydów. Aby przezwyciężyć te problemy, przyjęliśmy następującą procedurę. Pomysł opierał się na naszej powtarzanej obserwacji, że mAb 5-1-6 wiąże się z antygenem in situ w izolowanych kłębuszkach, gdzie można go łatwo wykryć technikami immunohistologicznymi (2). Dlatego też sądziliśmy, że jeśli ustabilizujemy kompleks antygen / przeciwciał nieprzepuszczalnym, rozszczepialnym chemicznym środkiem sieciującym, powinniśmy być w stanie wykryć zwiększony zakres mysich IgG związanych z antygenem, gdy kompleks zostanie rozstrzygnięty na SDS-PAGE pod nieredukowalnym warunki. Ponadto, poddając kompleks dwuwymiarowej (2D) elektroforezie żelowej w warunkach redukujących, sieciowanie ulegnie zakłóceniu, uwalniając antygen z ciężkich i lekkich łańcuchów IgG. Zastosowano nieprzepuszczalny środek sieciujący w celu uniknięcia ryzyka koprocesowania przypuszczalnych cytoplazmatycznych białek wiążących. Glomeruli wyizolowano przez przesiewanie różnicowe z 20 zamrożonych nerki szczurzego Sprague-Dawley. Po zablokowaniu 1% BSA w PBS z inhibitorami proteazy (PI) (1 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 5 mg / ml inhibitora trypsyny sojowej, 4 mM N-etylomaleimidu i 5 mM chlorowodorku benzamidyny) przez godzinę w temperaturze 4 ° C, kłębuszki inkubowano z 2 mg / ml albo mAb 5-1-6 lub RVG-1 w buforze blokującym przez godzinę w temperaturze 4 ° C. Po 5 przemyciach w PBS / PI, kłębuszki inkubowano z chemicznym środkiem sieciującym ditiobis (sulfosukcynimidopropionianem) (1 mM DTSSP, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, USA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Reaktywne miejsca zgaszono dodając M Tris (pH 8,0) do końcowego stężenia 50 mM przez kolejne 15 minut. [więcej w: astra wrocław godziny otwarcia, anielskie smaki, wegetariańskie przekąski ] [patrz też: wskazuje synonim, choroba synonim, olej z siemienia lnianego ]
