Po 3 przemyciach PBS, kłębuszki solubilizowano w buforze RIPA (1% Nonidet P-40, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,1% dodecylosiarczanu sodu w 50 mM Tris i 150 mM NaCl [pH 8,0]) z PI. Ekstrakt detergentowy wirowano przy 16,000 g w mikrowirówce stołowej przez 30 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału, a supernatant inkubowano ze sprzężonym z agarozem króliczym anty-mysim IgG, aby wytrącić stabilizowany kompleks antygen / przeciwciało. Osad przemywano dwukrotnie każdym z następujących buforów: bufor o wysokiej ostrości (HSB, 0,1% SDS, 1% deoksycholanu, 0,5% Triton-X 100, 20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 120 mM NaCl, 25 mM KCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA i 0,1 mM DTT), HSB z M NaCl i buforem o niskiej zawartości soli (2 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl [pH 7,5] i 0,5 mM DTT). Po solubilizacji w 100 .l nieredukującego buforu do próbek SDS-PAGE i wirowania, 10 .l supernatantu poddano SDS-PAGE. Rozdzielone białka zostały poddane elektrotransferowi na membrany nitrocelulozowe (Micron Separations Inc., Westborough, Massachusetts, USA) lub wybarwione na żelu Coomassie Brilliant Blue. Lokalizacja mysiej IgG oznaczono metodą Western blotting. Błony nitrocelulozowe blokowano 5% beztłuszczowym mlekiem w buforowanej Tris soli fizjologicznej / Tween 20 (TBST, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,2% Tween 20 [pH 7,6]) przez godzinę, a następnie inkubowano z kozim antygenem sprzężonym z HRP. -mouse IgG (1: 2000) przez godzinę. Po przepłukaniu membran 3-krotnie TBST, immunoreaktywne białka zidentyfikowano przy użyciu techniki chemiluminescencyjnej (Supersignal Chemiluminescent Substrate; Pierce Chemical Co.). Reaktywne prążki zastosowano do identyfikacji odpowiednich pasm na żelu barwionym Coomassie. Ten sam protokół zastosowano do przygotowania próbek do analizy żelowej 2D, z tym że kłębuszki izolowano ze 100 zamrożonych nerek i końcową immunoprecypitację solubilizowano w 50 ul redukującego buforu do próbek. Pozostały osad przemyto dwukrotnie wodą, a supernatanty połączono z solubilizowaną próbką, liofilizowano i ponownie zawieszono w 50. L wody. Dwuwymiarową elektroforezę w żelu przeprowadzono zgodnie z metodą O. Farrell przez Kendrick Labs Inc. (Madison, Wisconsin, USA) (12). Pięć mikrolitrów solubilizowanego immunoprecypitatu poddano izoelektrycznemu ogniskowaniu w szklanych probówkach o wewnętrznej średnicy 2 mm z użyciem 2% (pH 4 ~ 8) amfolin (BDH, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, Kalifornia, USA) dla 9600 woltów. Do każdej próbki dodano wewnętrzny standard ogniskowania izoelektrycznego, tropomiozynę (50 ng, pI 5.2, masa cząsteczkowa [MW] 33000). Gradient pH żelu w probówce oznaczano elektrodą pH na powierzchni. Po wyrównaniu przez 10 minut w buforze (10% glicerol, 50 mM ditiotreitol, 2,3% SDS, 62,5 mM Tris [pH 6,8]), żel w probówce zamknięto na wierzchu żelu do układania w stos, który z kolei był na wierzchu 10% żel akryloamidowy (grubość 0,75 mm). Wzorce masy cząsteczkowej dodano do agarozy, która uszczelniła żel w probówce: miozynę (220 000), fosforylazę A (94 000), katalazę (60 000), aktynę (43,000), anhydrazę węglanową (29 000) i lizozym (14 000) (Sigma). Chemical Co.). Elektroforezę w żelu SDS przeprowadzono na 4 godziny przy 12,5 mA / żel. Żele płytowe wybarwiono Coomassie Brilliant Blue R-250 lub utrwalono przez noc w 10% kwasie octowym / 50% metanolu i zabarwiono srebrem. Identyfikacja białka z 1-wymiarowych i 2D pasm żelu za pomocą spektrometrii mas. Prążki białka, które były przedmiotem zainteresowania wycięto z żeli SDS-PAGE i 2D do płytek i poddano w żelu proteolitycznemu trawieniu trypsyną zgodnie z procedurą Hellmana i in. (13). Chromatografia cieczowa / spektrometria masowa (LC / MS) i chromatografia cieczowa / spektrometria masowa / spektrometria masowa (LC / MS / MS) zostały zebrane na spektrometrze masowym LCQ Finnigan MAT (San Jose, Kalifornia, USA), wyposażonym w niestandardową konstrukcję LC źródło dostarczania ultra niskich przepływów (120. 180 nL / min). Peptydy powstałe w wyniku trawienia w żelu rozdzielono stosując kolumnę z topionej krzemionki 75-. M ID x 360-. M OD, zapakowaną w firmie Millennium Pharmaceuticals materiałem odwróconej fazy POROS 10R2 (Perceptive Biosystems, Framingham, Massachusetts, USA). i gradient 5 ~ 65% acetonitrylu w ciągu 30 minut, 65. 80% acetonitrylu w ciągu 5 minut, w 0,1 M kwasie octowym. LCQ działało w trybie zależnym od danych, w którym skany MS były naprzemiennie z automatycznym gromadzeniem MS / MS dla najbardziej intensywnego prekursora. Maksymalny czas wtrysku został ustawiony na 400 ms. Wszystkie spektrum MS / MS przeszukiwano na niepoliczalnej, białkowej bazie danych z National Center for Biotechnology Information (NCBI) przy użyciu MS-Tag (14). Konwencjonalne immunoprecypitowanie do immunoblotingu antynefryny
[patrz też: lekarz medycyny pracy wrocław, konwerter jednostek długości, olej z siemienia lnianego ]
[patrz też: centrum medyczne białystok, astra wrocław godziny otwarcia, anielskie smaki ]
