Chociaż konwencjonalne techniki immunoprecypitacji nie izolowały wystarczającej ilości materiału do sekwencjonowania, podejrzewaliśmy, że mAb 5-1-6 był zdolny do wytrącenia pewnego antygenu po ekstrakcji. Wraz z dostępnością swoistego przeciwciała antynadrenaliny poszukiwaliśmy obecności nefryny w osadzie metodą Western blotting. Glomeruli izolowano przez przesiewanie różnicowe z 10 zamrożonych nerek i solubilizowano z 0,5% Tritonem X-100 w PBS (pH 7,4) zawierającym 0,1% BSA i PI przez 30 minut na lodzie. Po odwirowaniu supernatant oczyszczono za pomocą 50 .l G-agarozy białkowej (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) przez godzinę w temperaturze 4 ° C. Oczyszczony supernatant inkubowano z 2 mg / ml mAb 5-1-6 lub RVG-1 przez noc w 4 ° C, a następnie przez 50 minut 50 .l agarozy białkowej G. Po odwirowaniu osad przemyto 5 razy PBS. Przemyte grudki i próbki przed i po strąceniu ekstraktu kłębuszkowego gotowano w buforze do próbek SDS zawierającym ditiotreitol przez 5 minut i wirowano, a 10 ul każdego supernatantu poddawano SDS-PAGE przy użyciu 7,5% lub 5% żelu. Po elektroblottingu do nitrocelulozy i blokowaniu w 4% odtłuszczonym mleku w PBS przez godzinę, błonę inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem przeciwrefrynowym (rozcieńczenie 1: 1000 w odczynniku blokującym) przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto 3 razy TBST. Królicze IgG wykrywano za pomocą sprzężonego z HRP koziej anty-króliczej IgG (rozcieńczenie 1: 5,000) przez godzinę. Po kolejnej serii płukań w TBST, immunoreaktywne białka wykryto przy użyciu techniki chemiluminescencyjnej. Autoradiografy skanowano do programu Adobe Photoshop 4.01 (Adobe Systems Inc., Mountainview, Kalifornia, USA), a densytometrię mierzono za pomocą oprogramowania NIH Image (wersja 1.61, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA). Immunofluorescencja. Przebadano zmrożoną tkankę nerki od normalnych szczurów Wistar. W przypadku podwójnego znakowania immunofluorescencji pośredniej sekcje 5. M kriostatu blokowano 1% BSA w PBS przez 30 minut. Normalne krioprobówki nerki inkubowano sekwencyjnie z mAb 5-1-6 (1:50) i króliczą anty-nefryną (1: 200) przez godzinę każda. Po kilku przemyciach PBS, skoniugowane z CY3 osiołowe anty-mysie IgG (1: 800) i skoniugowane z FITC kozie anty-królicze IgG (1: 100) dodano sekwencyjnie przez godzinę każda. Brak spektralnego nakładania się i reaktywności krzyżowej drugorzędowych przeciwciał zweryfikowano przez wykluczenie odpowiedniego pierwszorzędowego przeciwciała. Skrawki badano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej przy użyciu soczewki immersyjnej Nikon 40 × Plan Apo (Nikon Inc., Melville, New York, USA). Obrazy zostały przechwycone za pomocą kamery Spot CCD (Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, Michigan, USA) i wyeksportowane do programu Adobe Photoshop. Po zbudowaniu płyty kompozytowej uzyskano kolorowy wydruk przy użyciu drukarki termosublimacyjnej Kodak ColorEase. Wyniki Sieciowana immunoprecypitacja kompleksu mAb 5-1-6 / antygen. Figura pokazuje reprezentatywny Western blot dla mysich IgG usieciowanego immunoprecypitatu DTSSP po SDS-PAGE w warunkach nieredukujących. Na ścieżce mAb 5-1-6, mysie pasmo IgG jest identyfikowane przy 150 kDa, reprezentując nieskompleksowane mAb 5-1-6. Drugi, przesunięty w górę prążek jest również obecny na około 300 kDa w tym torze, który reprezentuje kompleks mAb 5-1-6 z jego antygenem. Prążek o masie 150 kDa jest również zidentyfikowany w ścieżce kontrolnej RVG-1, prawdopodobnie w wyniku nieswoistego wiązania kłębuszkowego. W przeciwieństwie do ścieżki 5-1-6 mAb nie ma jednak przesuniętego w górę kompleksu mysich IgG, co wskazuje, że kompleks 300 kDa jest wynikiem swoistej interakcji między mAb 5-1-6 i jego antygenem. Figura Reprezentatywna analiza Western blot dla mysiej IgG w usieciowanych immunoprecypitatach. Izolowany kłębuszek Sprague-Dawley inkubowano z mAb 5-1-6 lub RVG-1. Po przemyciu kompleks przeciwciało / antygen sieciowano DTSSP, a następnie rozpuszczono w detergencie i immunoprecypitowano kozim anty-mysim IgG związanym z agarozą. Osady rozdzielono przez nieredukujący 5% SDS-PAGE, poddano elektrotranslacji na nitrocelulozę, immunoblot z mysiej IgG i opracowano za pomocą techniki chemiluminescencyjnej. Mysie pasmo zawierające IgG jest widoczne przy 150 kDa na obu ścieżkach, zgodnie z nieskompleksowanym mysim mAb 5-1-6 lub RVG-1. Ponadto, pasmo jest specyficznie obecne w ścieżce IP mAb 5-1-6 przy około 300 kDa, co stanowi usieciowany kompleks mAb 5-1-6 i jego antygen. Analiza MS immunoprecypitatów mAb 5-1-6. Te same immunoprecypitaty, jak pokazano na Figurze 1, również rozdzielono przez SDS-PAGE i wybarwiono Coomassie Brilliant Blue R-250
[przypisy: powiększone serce przyczyny, anielskie smaki, miód gryczany zastosowanie ]
[hasła pokrewne: fundacja dantis, szybkowar czas gotowania, fundacje lublin ]
