Zgodnie z naszą wiedzą, nasze badanie jako pierwsze wykorzystało podwójnie transgeniczne myszy CEA-A2Kb do takich badań in vivo. Przetestowaliśmy dwa różne epitopy CEA ograniczone przez HLA-A2 . z naszymi szczepionkami minigenowymi DNA: CAP1-6D (YLSGADLNL) (9, 17) i CEA691 (IMIGVLVGV) (15). Szczepionka minigene DNA pHI-691 wyraźnie indukowała istotną odpowiedź CTL swoistą dla HLA-A2y, podobną do odpowiedzi CEA na ten sam peptyd CEA opisany u ludzi (15). Biologiczne znaczenie tego zwierzęcego modelu zostało potwierdzone, ponieważ u myszy podwójnie transgenicznych CEA-A2Kb, te CTL specyficznie zabijały komórki MC-38 transdukowane CEA-A2Kbp in vitro i chroniły myszy przed prowokacją tych komórek nowotworowych in vivo. Należy zauważyć, że transgeniczne myszy CEA-A2Kb nadal zawierają mysi repertuar receptora komórek T. W związku z tym Theobald i in. (26) wykazali, że korelacja między odpowiedzią immunologiczną na pewne epitopy Ag obserwowane u myszy transgenicznych HLA-A2 i odpowiedzi immunologicznej in vitro u ludzi niekoniecznie istnieje. W związku z tym, czy to zjawisko jest odpowiedzialne za niepowodzenie szczepionki minigene DNA pHI-CAP1-6D w indukowaniu swoistej wobec CAP1-6D p odpowiedzi CTL lub czy szczepionka minigene DNA pHI-CAP1-6D jako taka jest niewystarczająca do wywołania takiej odpowiedzi, zasługuje na więcej dochodzenie. Przesłanka stosowania peptydu HIVtat, który pochodzi z HIVtat Ag, w naszej szczepionce minigenu jest oparta na fakcie, że jest to jeden z powszechnie stosowanych peptydów przemieszczających błonę. Peptydy te są zdolne do transportu innych peptydów do retikulum endoplazmatycznego (ER) w sposób niezależny od TAP, gdzie mogą być przetwarzane i przycinane do epitopów CTL (27. 29). Takie peptydy można internalizować w sposób niezależny od receptora i niezależny od energii; jednak dokładny mechanizm, za pomocą którego mogą one przemieszczać się przez błonę plazmatyczną do cytoplazmy pozostaje nieznany (29). W naszej szczepionce CEA691 został sklonowany poniżej peptydu HIVtat, aby zapewnić jego prawidłowe dostarczanie i przetwarzanie w proteasomie. W związku z tym Lu et al. (29) wykazali, że poprzez połączenie z peptydem HIVtat, peptyd epitopu Ag można transportować do komórki z wytworzeniem kompleksów z cząsteczkami MHC klasy I w ER i regionie trans-Golgi. Ponadto okazało się, że doustnie dostarczana szczepionka minigenu DNA przeciwko mysiemu czerniakowi (tj. Plazmidowi kodującemu tylko peptydy) jest nieskuteczna w indukowaniu swoistej dla epitopu odpowiedzi (4). Gdy atenuowano S. typhimurium, niosąc wektor kodujący wyłącznie peptyd CEA691, użyto do immunizacji myszy, indukowały one specyficzną dla CEA691 odpowiedź wykrywaną za pomocą testów ELISPOT; jednak ta odpowiedź immunologiczna nie była tak skuteczna jak ta uzyskana ze szczepionką pHI-691 (dane nie przedstawione). Podsumowując, nasze dane pokazują, że obwodowa tolerancja komórek T przeciwko samemu antygenowi CEA może zostać zerwana przez naszą szczepionkę minigene DNA pHI-691 u myszy podwójnie transgenicznych CEA-A2Kb. Ta zdolność jest wskazana przez skuteczną, ograniczoną HLA-A2, specyficzną dla CEA691 odpowiedź CTL, która może specyficznie zabijać komórki raka okrężnicy MC-38 z transdukowanym CEA-A2Kb in vitro i chronić myszy przed prowokacją przez te komórki nowotworowe in vivo. Ta szczepionka minigenu DNA stanowi interesujący alternatywny projekt szczepionek DNA opartych na CEA do potencjalnego zastosowania klinicznego. Metody Zwierzęta, plamy bakteryjne i linie komórkowe. Homozygotyczne transgeniczne myszy rozpłodowe C57BL / 6J-CEA i C57BL / 6J-A2Kb wytworzono zgodnie z wcześniejszym opisem (18, 30). Podwójnie transgeniczne myszy C57BL / 6J-CEA-A2Kb wytworzono w obiekcie dla zwierząt w The Scripps Research Institute przez krzyżowanie samca C57BL / 6J-CEA z samicami myszy C57BL / 6J-A2Kb. Genotyp takich myszy został potwierdzony odpowiednio przez PCR i cytometrię przepływową. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Podwójnie atenuowany AroA S. typhimurium. i dam. szczep RE88 został dostarczony przez Remedyne Corporation (Santa Barbara, Kalifornia, USA). Linię komórek raka mysiego okrężnicy MC-38-CEA uzyskano jak opisano wcześniej (18). Komórki MC-38-CEA-A2Kb wytworzono przez transfekcję komórek MC-38-CEA plazmidem kodującym A2Kb. Wszystkie linie komórkowe hodowano w DMEM (Gibco, Invitrogen Corp., Grand Island, Nowy Jork, USA) uzupełnionym 10% (obj./obj.) FBS. Komórki MC-38-CEA hodowano w obecności mg / ml G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), a komórki MC-38-CEA-A2Kb hodowano z G418 i 0,5 mg / ml zeocyny. (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). T2, ludzka linia komórkowa HLA-A2 +, została pierwotnie uzyskana od P. Cresswella (Yale University, New Haven, Connecticut, USA) i uprzejmie dostarczona przez LA
[patrz też: olej z siemienia lnianego, konwerter jednostek długości, szybkowar czas gotowania ]
[więcej w: jako synonim, mycie włosów szarym mydłem, wypadek przy pracy dokumenty ]
