Kolejną linię komórkową HLA-A2 +, B3, ustalono przez transformację PBMC ze zdrowego osobnika HLA-A2 + z EBV. Konstrukcja wektorów ekspresyjnych. Wektor ekspresyjny pCMV / ER / Myc zakupiono od Invitrogen. Konstrukcja wektorowa jest schematycznie przedstawiona na rysunku 1A. Opracowano następujące wektory ekspresyjne: pHI-myc, pHI-CAP1-6D-myc i pHI-691-myc, gdzie peptyd HIVtat reprezentuje RKKRRQRRR, peptyd CAP1-6D reprezentuje YLSGADLNL (17), a peptyd CEA691 reprezentuje IMIGVLVGV (15). . Wszystkie peptydy zostały zaprojektowane tak, aby były w ramce z epitopem myc. Konstrukty zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie DNA w Bazie Podstawowej The Scripps Research Institute (La Jolla, Kalifornia, USA). Ekspresję peptydu wykazano metodą blottingu Western z przeciwciałem monoklonalnym anty-myc (Invitrogen). Po sprawdzeniu ekspresji peptydu kodon stop wprowadzono bezpośrednio przed sekwencjami epitopów myc. Uzyskane wektory, mianowicie pHI, pHI-CAP1-6D i pHI-691, zweryfikowano przez sekwencjonowanie i zastosowano do transformacji podwójnie atenuowanego S. typhimurium (damro; AroAa) do immunizacji. Pusty wektor pCMV również włączono do eksperymentów jako kontrolę. Transformacja S. typhimurium. Doustnie atenuowany S. typhimurium (damro; AroAa) transformowano plazmidami szczepionkowymi DNA przez elektroporację. W skrócie, świeżo przygotowane bakterie (1. 108), w fazie wzrostu midlora, zmieszano z plazmidem DNA (1 do 2 ug) na lodzie w kuwecie 0,1 cm i poddano elektroporacji przy 2,0 kV, 25 ° F i 100 |. Synteza peptydów. Peptyd CAP1-6D, o czystości powyżej 95% według HPLC, był prezentem od J. Schlom (National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA). Peptyd CEA691 został zsyntetyzowany przez Multiple Peptide System (San Diego, California, USA) o czystości powyżej 93% według HPLC. Szczepionka doustna i prowokacja komórek nowotworowych. Grupy myszy C57BL / 6J-CEA-A2Kb (n = 7. 10) immunizowano trzy razy w odstępach 2-tygodniowych przez zgłębnik za pomocą 100. L PBS, który zawierał w przybliżeniu 5. 108 podwójnie zmutowanych S. typhimurium niosących pCMV, pHI, pHI-CAP1-6D lub pHI-691. Myszy prowokowano podskórnie w prawym boku z 5. 105 komórek raka okrężnicy MC-38-CEA-A2Kb 2 tygodnie po ostatniej immunizacji. Guzy podskórne monitorowano codziennie. Myszy uśmiercono 28 dni po prowokacji nowotworem, a masy nowotworów określono i porównano z ciężarami osobników kontrolnych. Test cytotoksyczności. Cytotoksyczność zmierzono standardowym testem uwalniania chromu-51 (51Cr), jak opisano wcześniej, z pewną modyfikacją (31). Pokrótce, splenocyty zebrano 2 tygodnie po ostatniej immunizacji i stymulowano in vitro przez napromieniowane (1000 Gy) komórki MC-38-CEA-A2Kb w 37 ° C przez 5 dni w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FBS, L-glutaminą, 15 mM HEPES, nieistotne aminokwasy, pirogronian sodu, 2-ME i rekombinowana IL-2 w stężeniu 20 U / ml (PeproTech, Rocky Hill, New Jersey, USA). Splenocyty zebrano i rozdzielono z pożywką do oddzielania komórek Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario, Kanada). Komórki docelowe znakowano 51Cr przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej i inkubowano z komórkami efektorowymi w różnych stosunkach komórek efektorowych do docelowych w 37 ° C przez 4 godziny. Procent docelowej lizy komórek docelowych obliczono za pomocą wzoru [(ES) / (TS)]. 100, gdzie E jest średnim eksperymentalnym uwalnianiem, S jest średnim spontanicznym uwalnianiem, a T jest średnim całkowitym uwalnianiem. Testy ELISPOT. Testy ELISPOT przeprowadzono z zestawem ELISPOT (BD Biosciences Pharmingen, La Jolla, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. W skrócie, splenocyty izolowano 2 tygodnie po ostatniej immunizacji. Po lizie czerwonych krwinek za pomocą buforu do lizy ACK (Cambrex Bio Science, Walkersville, Maryland, USA), splenocyty ponownie zawieszono w końcowym stężeniu 2. 107, i 100. L tej zawiesiny inkubowano następnie ze 100. L pożywki z lub bez peptydów lub napromienionych komórek stymulatorów przez noc w 37 ° C na płytkach ELISPOT powleczonych anty-IFN-y. W niektórych przypadkach splenocyty stymulowano napromienionymi (1000 Gy) komórkami MC-38-CEA-A2Kb przez 5 dni, a następnie wykonywano testy ELISPOT. MACS i cytometria przepływowa. MACS przeprowadzono z użyciem anty-mysich sprzężonych kulek magnetycznych CD8 Ab (Miltenyi Biotec, Sunnyvale, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Czystość frakcjonowanych populacji komórek sprawdzono za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu skoniugowanego z fikoerytryną (sprzężonego z PE) anty-mysiego CD8Ab. Cytometria przepływowa została przeprowadzona przy pomocy 1. 106 komórek w FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornia, USA) wyposażonych w program CellQuest
[patrz też: sanatorium nad morzem dla dzieci, powiększone serce przyczyny, szybkowar czas gotowania ]
[patrz też: tatuowanie gałek ocznych, konwerter jednostek długości, olej z ostropestu właściwości ]
