Agregację kolagenu badano bardziej szczegółowo u wszystkich członków rodziny i różnych niespokrewnionych kontroli. Stężenie kolagenu potrzebne do uzyskania 50% agregacji płytek krwi z V: 4 i VI: jest znacznie wyższe niż dla płytek krwi z grupy kontrolnej lub normalnego członka IV: 6 (tabela 1). Reaktywność płytek z IV: 5 i V: 3 w kierunku kolagenu jest ponownie łagodnie zaburzona. Sugerowało to, że w płytkach z propositus (VI: 1) cyklaza adenylilowa jest już aktywowana w warunkach podstawowych. Oprócz zwiększonej odpowiedzi cAMP na iloprost, pacjent VI: istotnie wykazywał wyższe podstawowe poziomy cAMP (Figura 2A). Przeprowadziliśmy również pomiary cAMP w fibroblastach z VI: i stwierdziliśmy podobnie zwiększoną podstawową i stymulowaną odpowiedź cAMP (Figura 2B). Co ciekawe, pomiar aktywności cyklazy adenylanowej w fibroblastach od niespokrewnionego pacjenta z pełną trisomią 18 wykazał podobnie zwiększone podstawowe i stymulowane poziomy cAMP (Figura 2B). Figura 2. Aktywność cyklazy adenylanowej. (A) Pomiary poziomów cAMP w warunkach podstawowych przeprowadzono w dwóch powtórzeniach (lewy panel) lub po stymulacji iloprostem (1 ng / ml) w różnych odstępach czasu (prawy panel) w płytkach krwi od VI: (kwadraty) lub niepowiązanych kontroli (gwiazdki). (B) Pomiary poziomów cAMP w warunkach podstawowych, przeprowadzane w dwóch powtórzeniach (lewy panel) lub po stymulacji izoproterenolem (1 .M) w różnych odstępach czasu (prawy panel) w fibroblastach od VI: (kwadraty), pacjenta z pełna trisomia 18 (T18, trójkąty) lub niespokrewniona kontrola (gwiazdki). Wszystkie pomiary cAMP przeprowadzono w obecności inhibitora fosfodiesterazy IBMX (100 .M). PACAP (1-38) mRNA i nadekspresja białka. Wada genetyczna w jednym z Gs. izoformy mogły być wyłączone (13, 24, 25). Pacjent VI: ma normalny Gs. i poziom ekspresji białka XL i sekwencję kodującą dla Gs. gen i XL-ekson1 są całkowicie normalne (dane niepokazane). Ponieważ ten pacjent ma częściową trisomię 18p i monosomię 20p, te chromosomy zostały przebadane pod kątem potencjalnych genów. Gen dla PACAP (ADCYAP1) jest umiejscowiony na chromosomie 18p11.32 i jest możliwym kandydatem, ponieważ jego aktywny peptyd PACAP (1- . 38) stymuluje receptory sprzężone z Gs iw ten sposób aktywuje cyklazę adenylową. Analiza FISH z klonem YAC YAC 841C3 (23), który zawiera ADCYAP1, wykazała, że translokacja skutkuje trzema kopiami genu u pacjentów VI: i V: 4 (Figura 3). Figura 3Lokalizacja genu PACAP metodą FISH. Dwukolorowa FISH z sondą YAC 841C3 (zielona) i dwiema sondami centromerowymi dla chromosomów 18 i 20 (czerwona) dla pacjenta VI: i jego matki V: 3. Strzałki wskazują na sygnały PACAP. Fibroblasty ludzkiej skóry wyrażają PACAP (1- . 38) i receptor PACAP typu (26). MRNA PACAP (1-38) poddano nadekspresji w fibroblastach od pacjenta VI: 1, co określono za pomocą półilościowego RT-PCR (Figura 4A). PACAP ulega ekspresji w ludzkich megakariocytarnych liniach komórkowych MEG-01, DAMI i K562, a raczej słabą ekspresję stwierdzono w płytkach kontrolnych za pomocą RT-PCR (Figura 4B). Analiza Western blot wykazała ponadto, że płytki eksprymują receptor VPAC1, którego poziomy były prawidłowe u pacjenta (Figura 4C). PACAP (1-38) wykryto w ludzkim osoczu za pomocą testu ELISA; znacznie wyższe poziomy stwierdzono u pacjentów VI: i V: 4 oraz umiarkowanie zwiększone poziomy w IV: 5 i V: 3, w porównaniu z pulą w osoczu niepowiązanych kontroli lub IV: 6 (Figura 4D). Figura 4 wykrywanie PACAP w fibroblastach i osoczu. (A) Półilościowy RT-PCR z użyciem 20 i 17 cykli wykazał nadekspresję PACAP (1-38) w fibroblastach od pacjenta VI: w porównaniu z kontrolą. RT-PCR przeprowadzono na dwóch oddzielnych próbkach fibroblastów, a P-aktyna jest kontrolą wewnętrzną. (B) Detekcja mRNA PACAP w fibroblastach, megakariocytarne linie komórkowe DAMI, MEG-01 i K562 i płytki krwi przeprowadzono za pomocą RT-PCR. (C) Analiza immunoblot receptora VPAC1 (58 kDa) w płytkach krwi z dwóch niespokrewnionych kontroli i pacjenta VI: 1. (D) Detekcje PACAP metodą ELISA w osoczu z cytrynianu (lewy panel) lub ACD (prawy panel) krwi z VI: (kwadraty) i V: 4 (trójkąty) lub IV: 5 (kółka) i V: 3 (wypełnione diamenty ) w porównaniu z pulą osocza z cytrynianem (gwiazdkami) lub IV: 6 (otwarte romby). (E) Lewy panel pokazuje zależną od dawki stymulację przez PACAP (6. 38) indukowanej kolagenem (0,2. G / ml) agregacji prawidłowych ludzkich płytek; pokazano reprezentatywne ślady pięciu oddzielnych eksperymentów. Prawy panel ilustruje wpływ PACAP (6. 38) na indukowaną kolagenem (2 ug / ml) agregację płytek u pacjenta VI: 1. Coll, kolagen. Fizjologiczna rola PACAP w prawidłowych ludzkich płytkach krwi
[przypisy: astra wrocław godziny otwarcia, olej z siemienia lnianego, wegetariańskie przekąski ]
[patrz też: dokumenty synonim, sanatorium nad morzem dla dzieci, wskazuje synonim ]
