W innym zestawie eksperymentów fenotyp pacjenta został odwrócony, tj. Aktywność PACAP została zneutralizowana przez dodanie antagonisty PACAP PACAP (6. 38). PACAP (6. 38) wzmagał indukowaną kolagenem agregację prawidłowych ludzkich płytek krwi w sposób zależny od dawki (Figura 4E) i zmniejszone podstawowe poziomy cAMP (dane nie pokazane). Antagonista PACAP również indukował częściową, ale stałą poprawę indukowanej kolagenem agregacji płytek u pacjenta (Figura 4E). Rola dla PACAP w funkcji płytek krwi, badana na myszach. Zbadano różne modele mysie w celu dalszej oceny roli krążącego PACAP (1-38) jako fizjologicznego inhibitora funkcji płytek krwi. U myszy poziomy PACAP wykryte za pomocą ELISA były wyższe niż w ludzkim osoczu; ponadto stwierdziliśmy, że poziomy PACAP w surowicy były 1,5-krotnie wyższe niż w osoczu, co sugerowało, że płytki krwi mogą znacząco przyczyniać się do krążących poziomów PACAP (1. 38) (Figura 5A). Figura 5 Zwiększone poziomy PACAP i funkcji płytek krwi. (A) Poziomy PACAP wykryto za pomocą testu ELISA w osoczu (kółka) lub surowicy (kwadraty) zebranych z trzech myszy. (B) Analiza Southern błot DNA ogona. (C) Analiza immunoblot prepro-białek PACAP (20 kDa) w przemywanych uwalnianych płytkach krwi z pięciu myszy typu dzikiego w porównaniu z pięcioma myszami z nadekspresją PACAP (PACAP-Tg9). (D) Poziomy PACAP wykryto za pomocą testu ELISA w 0,00125 (5 osocza (szare słupki) lub 0,00125 (surowicy (czarne słupki) zebrane od trzech myszy typu dzikiego w porównaniu do trzech myszy PACAP-Tg9, przeprowadzonych w dwóch powtórzeniach. (E) Lewy panel: Średni czas krwawienia. SD dla myszy typu dzikiego lub PACAP-Tg9 (dziesięć zwierząt w każdej grupie, test t dla niesparowanego, P = 0,0001). Panel prawy: Pokazano indukowane kolagenem (5 .g / ml) agregaty płytek w hirudynizowanym PRP z dwóch myszy typu dzikiego i dwóch myszy PACAP-Tg9. Aby zbadać wpływ zwiększonego poziomu płytek PACAP na czynność płytek krwi, opracowano transgeniczne myszy z nadekspresją PACAP w linii komórek megakariocytów. Mysi gen PACAP umieszczono za płytkowym promotorem GPIIb, aby stymulować ekspresję specyficzną dla megakariocytów (16). Southern blot zidentyfikował trzech transgenicznych założycieli z transgenem linii zarodkowej, a linia założycielska Tg9, z wysokim poziomem ekspresji płytek PACAP, została wybrana i scharakteryzowana szczegółowo (Figura 5B). Oba poziomy PACAP w krążeniu i w krążeniu były zwiększone u myszy z nadekspresją PACAP, co wykryto za pomocą analizy immunoblot PACAP w przemytych uwalnianych płytkach krwi (Figura 5C) i detekcji ELISA PACAP w surowicy i osoczu (Figura 5D), odpowiednio. Ponadto, tak jak w przypadku pacjentów, transgeniczne myszy z nadekspresją PACAP wykazywały wydłużony czas krwawienia i wykazywały zmniejszoną wrażliwość na agregację indukowaną kolagenem (Figura 5E). Płytki myszy inkubowane z przeciwciałami anty-PACAP (10 .g / ml) wykazały wzmocnioną odpowiedź na kolagen (dane nie pokazane), a myszy, którym wstrzyknięto podskórnie przeciwciała anty-PACAP lub anty-VPAC1 wykazywały zwiększoną odpowiedź na ADP lub kolagen 7 dni po ostatnim wstrzyknięciu (Figura 6, A i B). Płytki krwi izolowane od myszy z niedoborem PACAP miały łagodnie (nie znacząco) obniżone podstawowe poziomy cAMP (myszy typu dzikiego, 133,2 . 15,2 pmola cAMP na 109 płytek krwi, myszy z niedoborem PACAP, 103,4. 6,39 pmola cAMP na 109 płytek krwi), a także zwiększoną wrażliwość na stymulację kolagenu podczas badań agregacji w porównaniu z płytkami krwi myszy kontrolnych (Figura 6C). Figura 6Zmniejszone poziomy PACAP i funkcji płytek krwi. (A) Agregacja płytek indukowana niskim stężeniem ADP (1,25 i 2,5. M) przy użyciu PRP od myszy, którym wstrzyknięto wskazane przeciwciała. (B) Agregacja płytek indukowana niskim stężeniem kolagenu (0,2 .g / ml) przy użyciu PRP od myszy, którym wstrzyknięto wskazane przeciwciała. Agregację płytek przeprowadzono w hirudynowanym PRP zebranym z pięciu myszy z każdej grupy, znormalizowanej do 250 x 109 płytek na litr. (C) Agregacja płytek indukowana we wskazanych stężeniach kolagenu przy użyciu cytrynianowego PRP od myszy normalnych (+ / +) lub z niedoborem PACAP (A / J). Agregację płytek przeprowadzono w PRP zebranym z trzech myszy w każdej grupie, znormalizowanych do 250 x 109 płytek na litr. Te zapisy były reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. Różnica w liniowej odpowiedzi na kolagen między rysunkiem 5E a rysunkiem 6C może być związana z różnymi stosowanymi antykoagulantami lub szczepami myszy. polycl., poliklonalne; monocl., monoclonal. Dyskusja Zgłaszamy hematologiczne konsekwencje nadmiernej ekspresji PACAP, w wyniku częściowej trisomii 18p. Ten neuropeptyd i jego receptory są szeroko rozpowszechnione, a zatem PACAP wywiera plejotropowe funkcje fizjologiczne
[patrz też: ziaja krem liście manuka, konwerter jednostek długości, zus dobrowolne ubezpieczenie zdrowotne ]
[więcej w: choroba synonim, olej z siemienia lnianego, centrum medyczne białystok ]
