Skromna stymulacja przez różne receptory płytkowe sprzężone z Gs u tych pacjentów wyzwala silną i szybką aktywację cyklazy adenylowej, tym samym antagonizując aktywację płytek krwi. Ponieważ stwierdziliśmy, że nadczynność Gs. ścieżka może prowadzić do fenotypu krwawienia (13), zbadaliśmy, jak częściowa trisomia 18p, która powoduje nadekspresję agonisty Gs PACAP i jest również związana z wyraźnym fenotypem krwawienia, wpływa na czynność płytek krwi. Stwierdziliśmy, że PACAP jest naturalnym regulatorem aktywacji płytek krwi. Ta dość nieoczekiwana rola PACAP w hemostazie została dodatkowo potwierdzona u myszy z nokautem PACAP i myszy ze specyficzną wobec megakariocytów nadekspresją PACAP. Metody Generowanie i genotypowanie myszy z nadekspresją specyficzną dla megakariocytów w analizach PACAP i Southern blot. Mysi promotor GPIIb (rozciągający się od +23 do 508 względem miejsca początku inicjacji) został wycięty z plazmidu mGPIIb-pGL3 przez trawienie KpnI i BamHI i wstawiony do wektora PACAP-pcDNA3.1 strawionego KpnI-BamHI (Invitrogen Corp Carlsbad, Kalifornia, USA) przed mysim genem PACAP (15). Mysi gen PACAP amplifikowano z cDNA mózgu ze starterami mPACAP1R5a-GTAGCCGCTCGAGGATCTGCTACAAGTATGC-3. i mPACAP4F 5 (3-GTTAGCCGAATTCAGTTCAAGGTCTGGCTAG-3 (3, sekwencjonowano i wklonowano w miejsce EcoRI-XhoI wektora pcDNA3.1. Fragment KpnI-DraIII o 2,2 kb (GPIIb-PACAP) wycięto i oczyszczono do wstrzyknięcia zygoty. Promotor GPIIb został z powodzeniem zastosowany do ograniczenia ekspresji transgenu do linii komórek megakariocytarnych myszy (16). Transgeniczne myszy z nadekspresją PACAP wytworzono przez wstrzyknięcie zygoty do wirusa Friend białaczka, szczep B (FVB) zgodnie z wcześniej opublikowanymi procedurami (17, 18). Potomstwo transgeniczne zidentyfikowano za pomocą przeszukiwania PCR przy użyciu genomowego DNA wyekstrahowanego z próbek ogona. Zastosowano następującą parę primerów: mGPIIb1F 5a-TGGCCACATCACAGCATTCAAG-3. i mPACAP1R. Przeprowadzono analizę Southern blot, aby zidentyfikować założycieli; 40 .g genomowego DNA strawiono SacI (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Niemcy), a cDNA PACAP zastosowano jako sondę. Produkcja przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych. Pierwotne monoklonalne przeciwciało anty-PACAP (PP1A4) i anty-PACAP, anty-regulator przeciwciał poliklonalnych G-sygnalizujących-2 (anty-RGS2) i przeciw-VPAC1 wytworzono w naszym laboratorium przez iniekcję odpowiednio myszy i królików z rekombinacją białka fuzyjne składające się z sekwencji peptydowej PACAP (1-38), kompletnej sekwencji VPAC1 lub N-końcowej części sekwencji RGS2, z których każdy sprzężony jest z S-transferazą glutationową. Te rekombinowane białka fuzyjne ulegały ekspresji w Escherichia coli i oczyszczane przez chromatografię powinowactwa na unieruchomionym glutationie (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Szwecja). Pierwotne przeciwciała oczyszczono na kulkach z białkiem A-Sepharose (Amersham Biosciences AB) i kontrolowano pod kątem ich reaktywności względem rekombinowanych PACAP (1- . 38), VPAC1 lub RGS2 przez immunoblot. Agregacja płytek ludzkich. Krew była antykoagulowana za pomocą 3,8% (wag./obj.) Cytrynianu trisodowego (9: 1), a osocze bogate w płytki (PRP), otrzymane przez odwirowanie (150 g przez 15 minut), ponownie wirowano (3000 g przez 15 minut) w celu wytworzenia osocze ubogie w płytki krwi (cytrynian PPP-trisodowy). Na koniec liczba płytek krwi w PRP została dostosowana do 250 x 109 płytek na litr za pomocą PPP. Agregację płytek przeprowadzono na dwóch dwukanałowych agregometrach Chrono-Log (Chrono-Log Corp., Havertown, Pennsylvania, USA) przez równoczesne rejestrowanie czterech zapisów. Badania zahamowania agregacji przeprowadzono jak opisano wcześniej (13, 14) i obejmowały krzywe dawka-odpowiedź do stabilnego analogu prostacykliny i agonisty ilirrostu Gs (Ilomédine; 0. 5 ng / ml; Schering AG, Berlin, Niemcy), który został dodany do PRP na minutę przed indukcją agregacji kolagenem Horm (2 .g / ml, Nycomed Arzneimittel, Monachium, Niemcy). Wartość IC50 obliczono po dopasowaniu krzywej za pomocą oprogramowania InStat 2.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornia, USA). Wartości IC50. SD porównywano z tymi dla tego samego agonisty Gs na płytkach kontrolnych, badanych jednocześnie. In vivo działanie przeciwciał anty-PACAP na agregację płytek u myszy. Myszom FVB wstrzyknięto trzy razy podskórnie 200 .l poliklonalnego przeciwciała anty-PACAP, anty-RGS2 lub przeciw VPAC1 lub czterokrotnie 50 .g mAb anty-PACAP (PP1A4) w odstępie 3 dni pomiędzy iniekcjami. W 14 dniu po pierwszym zastrzyku krew pełna z dolnej żyły głównej myszy znieczulona przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 60 mg / kg pentobarbitalu sodu została pobrana do 20 mg / ml hirudyny
[patrz też: ciąża miesiąc po miesiącu, lekarz medycyny pracy wrocław, smażenie na oliwie z oliwek ]
[więcej w: wypadek przy pracy dokumenty, tatuowanie gałek ocznych, konwerter jednostek długości ]
