Reakcję odwrotnej transkryptazy zakończono przez ogrzewanie przez 5 minut w 95 ° C. Zawartość cDNA normalizowano stosując startery dla P-aktyny. Następujące zestawy primerów użyto do wytworzenia specyficznych fragmentów: (3-aktyny a 5F (ACCAACTGGGACGACATGGAG) i a3R (CGTGAGGATCTTCATGAGGTAGTC) i PACAP (1 . 38) PACAP4F (GAAGCACCTGCAGTCGCTCG) i PACAP2R (TGTATACACAGGGTAGC). Wszystkie reakcje PCR (z 17 i 20 cyklami) również przeprowadzono w dwóch powtórzeniach na oddzielnych próbkach RNA fibroblastów. Wykrywanie PACAP w osoczu metodą ELISA. Krew była antykoagulowana przy użyciu 3,8% (wag./obj.) Cytrynianu trisodowego (9: 1) lub ACD, pH 6,5 (9: 1), a osocze (PPP) uzyskano przez odwirowanie przez 15 minut przy 3000 g. Poliklonalne przeciwciało anty-PACAP powleczono przez noc w 4 ° C na płytkach do mikromiareczkowania (Corning-Costar Corp., Cambridge, Massachusetts, USA) przy stężeniu 10 ug / ml w 200 ul PBS. Po zablokowaniu płytek 1% beztłuszczowym mlekiem w proszku w PBS, próbki osocza (0. 0,01. L / 200. L) osadzono w studzienkach przez noc w 4 ° C w PBS uzupełnionym 1% beztłuszczowego mleka w proszku i 0,002% ( vol / vol) Tween-80. Związany PACAP (1-38) został ujawniony przez drugorzędowe skoniugowane z HRP poliklonalne przeciwciało anty-PACAP (rozcieńczenie 1: 2500) i O-fenylenodiamina. Seria rozcieńczeń rekombinowanego PACAP (1-38) służyła jako standard ilościowy. Wyniki Opisy pacjentów. Opisujemy rodzinę charakteryzującą się niezrównoważoną segregacją translokacji wzajemnej t (18; 20) (p21; p13), w której kilku członków manifestuje poważne upośledzenie umysłowe (ryc. 1). Propositus (VI: 1) to 23-letni mężczyzna z wieloma problemami neurologicznymi (epilepsja, hipotonia, drgawki, upośledzenie umysłowe, drżenie, zachowania psychotyczne, zachowania hiperaktywne), problemy żołądkowo-jelitowe (biegunka, wymioty) i problemy endokrynologiczne ( niedorozwój przysadki mózgowej, hipogonadyzm hipogonadotropowy). Ponadto przedstawiał przy różnych okazjach umiarkowaną małopłytkowość, przy czym liczba płytek wynosiła 70 x 109 do 90 x 109 płytek na litr. Ma poważny problem z krwawieniem z powtarzającymi się epistaksjami, prowadząc nawet do wstrząsu hipowolemicznego i znacznie wydłużonym czasem krwawienia bluszczu (> 15 minut), chociaż badania krzepnięcia są normalne. Ma zmniejszone wydzielanie płytek ATP i a-tromboglobuliny pomimo płytkowej mikroskopii elektronowej wykazującej normalną gęstość i. granulki. Jego kariotyp przedstawia częściową trisomię 18p i monosomię 20p. Rysunek Prezentacja rodzinna. Kwadraty, męskie; koła, kobieta; wypełnione symbole, dotknięte osoby; otwarte symbole, nietknięte osoby. Czarne symbole przedstawiają członków z ciężkim upośledzeniem umysłowym i częściową trisomią 18p i monosomią 20p, a symbole w paski reprezentują członków o granicznym IQ i zrównoważonej translokacji t (18; 20) (p21; p13). Jego brat (VI: 2), ojciec (V: 2) i babka ze strony matki (IV: 6) są fenotypowo normalni, nie mają problemów z krwawieniem i mają prawidłowy kariotyp. Natomiast jego matka (V: 3) i dziadek ze strony matki (IV: 5) nie mają wyraźnych zaburzeń neurologicznych, ale graniczne iloraz inteligencji. Niosą zrównoważoną translokację t (18; 20) (p21; p13). Nie mają oczywistych problemów z krwawieniem i mają prawidłową liczbę płytek krwi. 47-letni wujek propositus (V: 4) również cierpi z powodu znacznego upośledzenia umysłowego, hipogonadyzmu, wyraźnej nawrotowej epistaksji i wnętrostwa. Ponadto często ma krwawienie z żołądka, a jego liczba płytek krwi wynosi około 150 x 109 płytek krwi na litr. Ma też częściową trisomię 18p i monosomię 20p. Pacjenci i / lub ich przedstawiciele prawni wyrazili zgodę na oznaczenie aktywności płytek krwi i fibroblastów Gs oraz analizę molekularną. Aktywność cyklazy adenylizlowej w płytkach krwi i fibroblastach. Propositus (VI: 1) ma zaburzoną funkcję płytek potwierdzoną przez wzmocnienie aktywności Gs zmierzone w teście hamowania agregacji płytek, która wydaje się podobna do tej, którą opisaliśmy wcześniej dla pacjentów z indukowalnym zespołem hiperfunkcji Gs (13, 14 ). Płytki krwi od pacjentów (VI: i V: 4) z częściową trisomią 18p i monosomią 20p miały istotnie zwiększoną wrażliwość na agonistę G1 iloprost (Tabela 1), natomiast płytki krwi od członków rodziny (IV: 5 i V: 3 ) przy zrównoważonej translokacji wykazywał umiarkowanie zwiększoną czułość. Wartość IC50 dla członka IV: 6 z prawidłowym kariotypem mieści się w zakresie wartości IC50 od 22 niepowiązanych kontroli. Tabela 1: Agregacja płytek krwi Ważną różnicą między pacjentami z tej rodziny a pacjentami z indukowalną hiperfuncją Gs, którą opisywaliśmy wcześniej, jest ich zmniejszona wrażliwość na różnych agonistów płytek (kolagen, ADP i U46619).
[hasła pokrewne: astra wrocław godziny otwarcia, fundacja dantis, centrum medyczne białystok ]
[podobne: zus dobrowolne ubezpieczenie zdrowotne, powiększone serce przyczyny, dantis ]
