W miarę postępu choroby histonowana 3 lizyna 4 (H3K4) ulega demetylacji, a histon 3 lizyna 9 (H3K9) ulega metylacji. Wreszcie, gdy dojdzie do cukrzycy, następuje metylacja wyspy CpG w proksymalnym promotorze Pdx1, blokowanie znaczącej supresji Pdx1. Są to pierwsze badania na naszą wiedzę, aby opisać ontogenezę przebudowy chromatyny in vivo od płodu do początku choroby w wieku dorosłym. Wyniki Transkrypcja Pdx1 jest zmniejszona w wysepkach IUGR. We wcześniejszych badaniach stwierdziliśmy, że poziomy mRNA Pdx1 były zmniejszone o 50% u płodów i 2-tygodniowych szczeniąt oraz u 80% u dorosłych zwierząt z RCZG (6). Aby określić, czy to obniżenie poziomu mRNA Pdx1 było drugorzędne w porównaniu ze zmniejszeniem transkrypcji genu Pdx1, czy też wzrostem stabilności mRNA, indukowaliśmy IUGR u myszy reporterowych transkrypcji in vivo Pdx1-LacZ. Transgen był regulowany przez fragment XbaI-XbaI o wielkości 4,6 kb, zawierający 4,5 kb mysiego promotora Pdx1 i większość 5. region nieprzetłumaczony (UTR). Większość ważnych wzmacniaczy Pdx1 opisanych do tej pory jest zawartych w tym fragmencie promotora (17. 19). Poziomy endogennego Pdx1 mRNA są zmniejszone o 50,4%, a mRNA lacZ w limfocytach ulega równoległemu zmniejszeniu o około 57,1% (P <0,05 w porównaniu z kontrolą). Wskazuje to, że IUGR reguluje mRNA Pdx1 przez zmniejszanie aktywności promotora transkrypcyjnego lub elementów wzmacniacza w proksymalnym Pbx1,5-kb. region. Stan metylacji promotora genu Pdx1 w IUGR i kontrolnych wysepkach. Proksymalny 5. region flankujący genu Pdx1 i jego pierwszy ekson obejmują wysoce konserwatywną wyspę CpG, która obejmuje nukleotydy. 360 do +200 względem miejsca początku translacji (Figura 1A). Aktywne promotory są związane z niemetylowanymi wyspami CpG i otwartą strukturą chromatyny, podczas gdy nieaktywne promotory typowo charakteryzują się represją struktury chromatyny i hipermetylowanymi CpGs. Określiliśmy status metylacji DNA części wyspy CpG, która znajduje się w promotorze Pdx1 w wysepkach IUGR i kontroluje zwierzęta, stosując analizy wodorosiarczynowe i analizy pirosekwencyjne. Ocena DNA z wysepek 5 zwierząt z IUGR i 5 zwierząt kontrolnych ujawniła, że w wieku 2 tygodni żadne z 14 miejsc CpG w promotorze Pdx1 nie ulegało metylacji w wysepkach ani z IUGR, ani ze zwierząt kontrolnych. W wieku 6 miesięcy (n = 5 zwierząt na grupę) poziomy metylacji DNA Pdx1 na wyspie CpG wynosiły średnio 51,3%. 10,3% w porównaniu z brakiem metylacji CpG w grupie kontrolnej (P <0,05 w porównaniu z grupą kontrolną). Żadne pojedyncze miejsce CpG nie było konsekwentnie metylowane (Figura 1B). Figura Status metylowania proksymalnego promotora Pdx1. (A) Mapa Pdx1. Proksymalny promotor Pdx1 jest częścią bardziej rozbudowanej wyspy CpG. Wypełnione kółka reprezentują dinukleotydy CpG, a liczby wskazują pozycje względem miejsca startu transkrypcji. Wskazano położenie skrzynki E związanej przez USF-1. (B) Metylacja dinukleotydów CpG w obrębie promotora Pdx1. Wysepki izolowano od 5 zwierząt z IUGR i 5 zwierząt kontrolnych w wieku 6 miesięcy, a metylację DNA Pdx1 oceniano ilościowo przez pirosekwencjonowanie DNA potraktowanego wodorosiarczynem. Nie wykryliśmy metylacji w jakimkolwiek CpG Pdx1 w kontrolach. Zacienione słupki reprezentują dane uzyskane i uśrednione dla 5 zwierząt IUGR i przedstawione jako procent metylacji w każdym miejscu CpG. Dane są. SEM. Wiązanie metylotransferaz DNA w Pdx1 w wysepkach IUGR. Do metylacji ssaczej CpG pośredniczą 3 aktywne metylotransferazy DNA (Dnmts), Dnmt1, Dnmt3a i Dnmt3b. Dnmt1 pośredniczy w utrzymywaniu replikacji w zachowaniu wzorców metylacji DNA, podczas gdy Dnmt3a i Dnmt3b uważa się za metylazy DNA de novo (20, 21). Co zaskakujące, zaobserwowaliśmy pewne powiązanie Dnmt1 z Pdx1 w wysepkach 2-tygodniowych szczeniąt IUGR, pomimo braku metylacji DNA CpG (Figura 2). Jednak w tym wieku nie było wiązania Dnmt3a lub Dnmt3b z Pdx1. W wieku 6 miesięcy, gdy metylacja DNA w Pdx1 była zwiększona w wysepkach IUGR, wiązanie Dnmt1 było znacząco zwiększone (Figura 2) i umiarkowane poziomy Dnmt3a, ale nie Dnmt3b, również były związane z Pdx1 (Figura 2). Nie stwierdzono wiązania Dnmt1 lub Dnmt3a i -3b z Pdx1 na kontrolnych wysepkach w żadnym wieku. Figura 2 Ilościowa analiza Dnmt1, Dnmt3a i Dnmt3b związanych w regionie promotora Pdx1. Analiza ChIP sieciowanej chromatyny z wysepek IUGR i zwierząt kontrolnych w wieku 2 tygodni i 6 miesięcy IP z przeciwciałem wobec Dnmt1, Dnmt3a i Dnmt3b. Próbki kontrolne (Con) i IUGR były prowadzone na tym samym żelu. Wejściowy DNA (In) reprezentuje produkty PCR bez uprzedniego IP. IP IgG wykazywał znikomy produkt PCR, co wskazuje na niewielkie lub zerowe IP przy braku pierwotnego przeciwciała [podobne: zus dobrowolne ubezpieczenie zdrowotne, mycie włosów szarym mydłem, wypadek przy pracy dokumenty ] [patrz też: lekarz medycyny pracy wrocław, olej z siemienia lnianego, centrum medyczne białystok ]
