Zwierzęta znieczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (Nembutal; 60 mg / kg) i wdychanie metoksyfluranu (Metofane, Schering-Plough Animal Health Corp., Union, New Jersey, USA) dostosowanego do utrzymywania częstości oddechów 60. 80 oddechów / min. Wszystkie czynności związane z opieką nad zwierzętami i procedury eksperymentalne były zgodne z Przewodnikiem dla opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, Departamentem Zdrowia, Edukacji i Opieki Społecznej i zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami w Instytucie Badawczym Scripps. Uraz szyjny i zakrzepica. Męskie myszy WT, ob / ob i db / db, w wieku 6. 9 tygodni, poddano uszkodzeniu tętnicy szyjnej przy użyciu FeCl3, jak opisano wcześniej (19, 20). Pokrótce, lewą tętnicę szyjną znieczulonej myszy ostrożnie odsłonięto przez tępe rozcięcie i pasek 0,5 x 1,0 mm mm z Whatman nr. bibułę filtracyjną nasączoną 10% roztworem FeCl3 nałożono na powierzchnię naczynia na 3 minuty. Przepływ krwi w tętnicy szyjnej monitorowano przed i ponad 25 minut po urazie, jak opisano (19), i uważano, że całkowite zakrzepnięcie zakrzepowe występuje, gdy przepływ zmniejszył się do 0,0. 0,2 ml / min. W niektórych doświadczeniach, rekombinowana leptyna myszy (Peprotech Inc., Rocky Hill, New Jersey, USA); zawartość endotoksyny <0,1 ng / mg leptyny) podawano myszom przed uszkodzeniem, jak wskazano w tekście. Poziomy glukozy, insuliny i leptyny w surowicy. Glukozę w surowicy oznaczano enzymatycznie przy użyciu metody heksokinazy (Sigma Diagnostics, St. Louis, Missouri, USA), podczas gdy stężenia insuliny w surowicy mierzono za pomocą monoklonalnego testu immunologicznego anty-szczurzego insuliny połączonego z insuliną (Crystal Chem Inc., Chicago, Illinois, USA). ). Stężenie leptyny w surowicy określano za pomocą dwóch specyficznych testów immunologicznych anty-mysiej leptyny (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA i Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, USA, odpowiednio). Testy ELISA przeprowadzono w dwóch powtórzeniach dla każdej próbki. Przygotowanie płytek. Ludzkie płytki krwi przygotowano standardowymi procedurami z użyciem krwi poddanej antykoagulacji z użyciem kwaśnej dekstrozy. W celu wyizolowania mysich płytek krwi, z krwi znieczulonej myszy zebrano nakłucie serca za pomocą igły 25 G. Krew zebrano od pięciu do sześciu zwierząt dla każdego doświadczenia. Odwirowano ją przy 150 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunięto warstwę osocza bogatopłytkowego (PRP). Płytki krwi zliczono w spektrofotometrze przy długości fali 800 nm, rozcieńczono buforem Tyrodesa (5 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1% BSA i 0,1% D-glukozy) do standardowego stężenia 3 x 108 / ml i natychmiast wykorzystywane do eksperymentów agregacji przy użyciu ADP. Aby otrzymać przemyte płytki do badań agregacji za pomocą trombiny, dodano .M prostaglandyny E1 i U / ml apyrazy, po czym odwirowano przez 15 minut przy 500 g. Supernatant (osocze ubogie w płytki [PPP]) usunięto, a grudkę płytek delikatnie zawieszono ponownie w buforze soli fizjologicznej 1,4-piperazynodietanosulfonowej (PIPES) (0,15 M NaCl i 20 mM PIPES, pH 6,5) zawierającym apyrazę (1 U / ml) i prostaglandyny E1 (5 .M) i odwirowano przy 500 g przez 15 minut. Osadowane płytki ponownie zawieszono w buforze Tyrode a, policzono i rozcieńczono do stężenia 3 × 108 / ml. Agregacja płytek i krzepnięcie osocza. Badania agregacji płytek przeprowadzono na czytniku mikropłytek (21) przy użyciu oprogramowania do akwizycji danych SOFTmax Pro (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, California, USA). W każdym dołku umieszczono 5 .l ADP lub roztworu trombiny w różnych stężeniach, a następnie dodano 95 .l świeżo przygotowanego PRP do badań ADP lub przemyte płytki do badań trombiny. Aby ocenić wpływ leptyny na agregację płytek, PRP inkubowano z różnymi stężeniami leptyny przez 5 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem do studzienek zawierających ADP lub trombinę. Odczyty były wykonywane co 30 sekund w okresie 5 minut przy długości fali 405 nm dla przemywanych płytek lub przy długości fali 560 nm dla PRP. Wszystkie badania agregacji płytek przeprowadzono trzykrotnie i powtórzono je co najmniej trzy razy z podobnymi wynikami. Zmiany w przepuszczalności światła w czasie wyrażono jako procent światła przepuszczalności PPP, przy czym transmisja nieprzetworzonego PRP służyła jako standard zerowy. Wykresy procentowej transmisji światła w funkcji czasu (ślady agregacji) zostały skonstruowane przy użyciu standardowych programów komputerowych. Aby przeprowadzić badania krzepnięcia, PPP człowieka lub myszy inkubowano z leptyną (100 ng / ml) przez 5 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem trombiny (0,5 U / ml). Próbkę ponownie zaszczepiono 2 mM CaCl2 bezpośrednio przed pierwszym odczytem mikropłytki (długość fali, 560 nm). Analiza statystyczna [patrz też: ciąża miesiąc po miesiącu, sanatorium nad morzem dla dzieci, konwerter jednostek długości ] [hasła pokrewne: smażenie na oliwie z oliwek, sanatorium nad morzem dla dzieci, badanie kału na pasożyty ]
