W tych warunkach poziomy mRNA Twist były zmniejszone w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami Nl hodowanymi zarówno w konfluencji wstępnej, jak i konfluencji (Figura 2). Było to związane ze znaczącymi zmianami w ekspresji genów markerowych osteoblastów. Poziomy mRNA ALP były znacznie zwiększone (dwukrotnie do trzykrotnego) w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami NI zarówno w konfluencji wstępnej, jak i konfluencji (Figura 4, aib). Poziomy mRNA COLIA1 były również znacząco zwiększone w komórkach zmutowanych w porównaniu z komórkami NI hodowanymi w tej samej gęstości (Figura 4, aib). Przeciwnie, komórki M-Tw wykazywały znaczny spadek poziomów mRNA OC w porównaniu z komórkami NI (Figura 4a). Ilościowe analizy ekspresji genów potwierdziły, że poziomy transkryptów mRNA OC były dwukrotnie lub trzykrotnie niższe w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami N1 (Figura 4b). Podobne wyniki uzyskano w konfluencji wstępnej i konfluencji, potwierdzając niezależną zmianę wzrostu ekspresji OC w komórkach M-Tw. Tak więc mutacja Y103X Twist powodująca zmniejszone dawkowanie Twist w ludzkich komórkach Calvaria jest związana ze zwiększoną ALP i COLIA1, ale zmniejszoną ekspresją genu OC, niezależnie od wzrostu komórki. Rycina 4Zmniejszone dawkowanie skrętu zmniejsza ekspresję OC w osteoblastach kości piętowej. Kontrolne (NI) i zmutowane (M-Tw) komórki kalibii hodowano aż do osiągnięcia wstępnego zlepienia (PC, 2 dni) lub konfluencji (C, 4 dni) i określono ekspresję genów markera osteoblastów. (a) Całkowity komórkowy RNA poddano odwrotnej transkrypcji i cDNA powielono przez PCR w celu zbadania ekspresji transkryptów ALP, COLIA1, OC lub GAPDH, a następnie analizy Southern blot. (b) Analizę densytometryczną poziomów mRNA przeprowadzono po korekcie GAPDH (średnia . SEM z trzech eksperymentów, AP <0,05 w porównaniu do komórek N1). Zmniejszone dawkowanie skrętu zwiększa osteogenezę in vitro. Następnie wykonaliśmy analizy in vitro, aby określić wpływ mutacji Y103X Twist na tworzenie macierzy przez osteoblasty z kalwarii podczas osteogenezy in vitro. Podczas hodowli w obecności kwasu askorbinowego, który sprzyja powstawaniu macierzy i osteogenezy in vitro (20), komórki M-Tw i Nl szybko wytwarzają struktury ALP + podobne do guzków. Jednak komórki M-Tw wytwarzały większe i większe guzki niż komórki NI w tym samym okresie czasu (8 dni) (Figura 5a). Analiza ilościowa wykazała, że komórki M-Tw wytwarzają czterokrotnie więcej guzków niż komórki N1 (Figura 5b), co pokazuje zwiększoną zdolność osteogeniczną komórek M-Tw in vitro. W celu dalszej oceny zdolności zmutowanych komórek do tworzenia matrycy kolagenowej in vitro, komórki M-Tw hodowano w agregatach, w warunkach sprzyjających osteogenezie w hodowlach ludzkich komórek Calvaria (23, 25). W tych warunkach komórki M-Tw tworzyły dużą ilość zwapniałej i niezwapnionej macierzy w agregatach po 14 dniach hodowli (Figura 6a). W przeciwieństwie do tego, komórki Nl formowały jedynie małe obszary matrycy (Figura 6b). Analiza biochemiczna przeprowadzona w równoległych hodowlach agregatów wykazała, że aktywność ALP była zwiększona w hodowlach komórek M-Tw w porównaniu z komórkami N1 podczas pierwszych 3 dni hodowli w agregatach (Figura 6c). Zwiększona osteogeneza in vitro była również związana z wyraźnym wzrostem syntezy kolagenu typu I, jak ujawniły poziomy P1CP (Figura 6d). Potwierdza to, że zmniejszone dawkowanie Twist wzmacnia te markery osteoblastów w zmutowanych komórkach podczas osteogenezy in vitro i zwiększa tworzenie kolagenowych macierzy przez komórki M-Tw podczas osteogenezy in vitro. Figura 5 Zmniejszone dawkowanie skrętu zwiększa tworzenie struktur guzkowych przez zmutowane osteoblasty z kalwarii. Kontrolne (NI) i zmutowane (M-Tw) komórki kalibii wysiano w tej samej gęstości w obecności kwasu askorbinowego w celu zaindukowania tworzenia się guzków. (a) Pokazano tworzenie guzków (strzałki w górnym panelu, x 125) i tworzenie macierzy (M w dolnym panelu, x 250). Liczbę guzków ALP + określono po 8 dniach hodowli (b). Dane są średnie. SEM z trzech do czterech kultur. AP <0,01 vs. komórki Nl. Figura 6 Zmniejszone dawkowanie skrętu zwiększa osteogenezę in vitro przez zmutowane komórki Calvaria. Kontrolne (NI) i zmutowane (M-Tw) komórki kalibii hodowano w agregatach. Histologiczne sekcje o grubości 5 urn barwione trichromem Goldnera wykazały zwiększoną ilość osteoidu (O) i zwapniałą matrycę (M) utworzoną przez komórki M-Tw (a) w porównaniu z komórkami N1 (b) po 14 dniach hodowli (x 250 ). (c) Zwiększona aktywność ALP i (d) synteza kolagenu typu I, określona na podstawie poziomów P1CP w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami Nl hodowanymi w agregatach. Dane są średnie. SEM z trzech do czterech kultur. AP <0,05 względem komórek N1. Zredukowana dawka skrętu zwiększa syntezę macierzy in vivo. W celu dalszego scharakteryzowania zdolności osteogennej zmutowanych komórek Twist in vivo, przeanalizowaliśmy zdolność tworzenia matrycy komórek M-Tw hodowanych na porowatych ceramicznych materiałach HA, które zostały wszczepione myszom nagim [hasła pokrewne: badanie kału na pasożyty, olej z siemienia lnianego, ziaja krem liście manuka ] [więcej w: powiększone serce przyczyny, wegetariańskie przekąski, smażenie na oliwie z oliwek ]
