W tych warunkach matrycę utworzoną przez komórki wzdłuż wszczepionego HA można wykryć histologicznie, podczas gdy ceramika HA nie jest już widoczna z powodu procesu odwapniania (Figura 7). Analiza histologiczna po 8 tygodniach implantacji wykazała zwiększoną ilość tkanki kostnej utworzonej przez komórki M-Tw wzdłuż materiału HA (Figura 7b), podczas gdy tworzenie osteoidów przez komórki N1 było słabe (Figura 7a). Materiał HA wszczepiony bez komórek nie wykazywał tworzenia matrycy (nie pokazano). Histomorfometryczna analiza macierzy osteoidalnej wykazała, że komórki M-Tw utworzyły czterokrotnie więcej macierzy osteoidalnej niż normalne komórki w 4 i 8 tygodniu wszczepienia (Figura 7c). To pokazuje, że mutacja Twista powodująca zmniejszoną dawkę Twist indukuje zwiększone tworzenie macierzy kostnej in vivo, co potwierdza analizę in vitro. Figura 7 Zwiększona produkcja matrycy przez zmutowane komórki Calvaria Twist in vivo. Kontrolne (NI) i zmutowane (M-Tw) komórki kalibii wstępnie inkubowano na HA, który wszczepiono podskórnie myszom nagim. Po 4. 8 tygodniach, materiał został zatopiony, sekcje o grubości 5. M wybarwiono trójchromem Goldnera i określono ilościową macierzą osteoidalną utworzoną wzdłuż HA. Implanty ceramiczne HA nie były już widoczne po procesie odwapnienia. Komórki M-Tw (b) tworzyły zwiększoną ilość osteoidu (czerwoną) zdeponowaną wzdłuż HA, w porównaniu z komórkami N1 (a) (x 250). (c) Analiza histomorfometryczna wykazała, że ilość matrycy utworzonej przez komórki M-Tw była większa niż w kontrolnych komórkach N1 (średnia . SEM, AP <0,05 w porównaniu do komórek N1). Zredukowana dawka skrętów zmienia geny markera osteoblastów podczas osteogenezy in vitro. Aby dodatkowo zidentyfikować wpływ mutacji Twista na geny markerowe osteoblastów, badaliśmy kinetykę ekspresji genów markerowych Twist i osteoblastów podczas osteogenezy in vitro. Komórki M-Tw i Nl hodowano w warunkach, w celu wytworzenia struktur guzkowych do 8 dni, i określono poziomy mRNA. Jak pokazano na Figurze 8, poziomy skrętnego mRNA pozostawały niższe w komórkach M-Tw niż w komórkach N1 podczas osteogenezy in vitro (Figura 8, aib). W tych warunkach hodowli poziomy mRNA ALP początkowo zwiększano w 4 dniu w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami N1 (Figura 8, aib). Następnie poziom mRNA ALP był podobny w komórkach M-Tw i Nl w 6 do 8 dni, gdy komórki utworzyły guzki. Podobnie poziomy mRNA COLIA1 początkowo były zwiększone w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami N1, a następnie nie różniły się znacząco (Figura 8, aib). Przeciwnie, poziomy mRNA OC były znacznie zmniejszone w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami N1 przez 4 do 8 dni hodowli, tj. Podczas tworzenia guzków (Figura 8, aib). Tak więc mutacja Twista powodująca zmniejszoną dawkę Twist początkowo zmienia ekspresję ALP i COLIA1 i trwale obniża ekspresję genu OC w zmutowanych osteoblastach podczas osteogenezy in vitro. Ogólnie, wyniki pokazują, że fenotyp wywołany mutacją Y103X Twist, powodującą skrętność haploinowa w osteoblastach ludzkich kości, charakteryzuje się zwiększoną proliferacją komórek, zmniejszoną ekspresją OC oraz zwiększoną syntezą kolagenu typu I i osteogenezy in vitro i in vivo, co wskazuje, że przedwczesne kostnienie szwów czaszkowych w zespole Saethre-Chotzen a jest wtórne do zmiany tych genów różnicowania osteoblastów. Figura 8 Zmniejszona dawka skręcona w różny sposób wpływa na geny markerowe osteoblastów podczas osteogenezy in vitro. Kontrolne (NI) i zmutowane (M-Tw) komórki kalibii wysiano na tej samej gęstości komórek, aby sprzyjać różnicowaniu komórek i tworzeniu struktur sferycznych. (a) Całkowity komórkowy RNA poddano odwrotnej transkrypcji i cDNA powielono przez PCR w celu zbadania ekspresji transkryptów Twist, ALP, COLIA1, OC lub GAPDH, a następnie analizy Southern blot. (b) Analiza densytometryczna poziomów mRNA po korekcji GAPDH (średnia . SEM z trzech eksperymentów, AP <0,05 w porównaniu do komórek N1). Dyskusja Przedwczesne zespolenie szwów czaszkowych w zespole Saethre-Chotzen jest związane z mutacjami w genie Twist (2, 3). Jednak nie zidentyfikowano wpływu mutacji Twista na fenotyp komórkowy i docelowych genów dla Twist w osteoblastach z ludzkiej kalibii. W tym badaniu określiliśmy fenotyp wywołany delecją domeny bHLH w genie Twist in vitro i in vivo oraz zidentyfikowaliśmy geny docelowe w zmutowanych osteoblastach ludzkiej kalwarii. Okazało się, że większość mutacji w zespole Saethre-Chotzen wpływa na domenę bHLH Twist (2, 3). Ponieważ ta domena funkcjonalna bHLH jest niezbędna w funkcji transaktywującej czynników transkrypcyjnych bHLH (4), badaliśmy fenotyp komórkowy indukowany przez mutację Y103X powodującą delecję całej domeny bHLH [podobne: mycie włosów szarym mydłem, wypadek przy pracy dokumenty, olej z ostropestu właściwości ] [hasła pokrewne: sanatorium nad morzem dla dzieci, badanie kału na pasożyty, lekarz medycyny pracy wrocław ]
