Zgodnie z mutacją Y103X wprowadzającą kodon stop, stwierdzono zmniejszenie poziomów białka Twist w zmutowanych komórkach. Utrata funkcji twist związana z delecją bHLH może również być związana z degradacją białka (34). Ponadto stwierdziliśmy, że mutacja obniżyła poziom mRNA Twist. Zatem fenotyp indukowany przez mutację Y103X Twist w komórkach ludzkich Calvaria wynika ze zmniejszonej dawki Twist. Następnie określiliśmy zmiany wzrostu komórek i markery genów osteoblastów indukowane przez Twist utratę funkcji. Redukcja dawki Twist w zmutowanych osteoblastach z calvari indukowała dwukrotny wzrost zmutowanego wzrostu komórek, co sugeruje, że Twist działa jako represor proliferacji komórek w osteoblastach ludzkiej kości. Dysocjacja między szybkością proliferacji komórek i liczbą zmutowanych i kontrolnych komórek także sugeruje, że tempo apoptozy może się różnić w dwóch typach komórek (35). Mechanizmy molekularne związane z wpływem mutacji na wzrost komórek nie są jeszcze znane. Eksperymenty w Drosophila sugerują, że D-Twist może wpływać na ekspresję homologu FGFR, DFR1 (36). Twist zasugerowano również, aby regulować ekspresję FGFR podczas rozwoju czaszkowo-twarzowego u myszy (37), sugerując implikację FGFR w fenotypie komórkowym wywołanym przez Twist. Nie stwierdziliśmy żadnych zmian w ekspresji mRNA i białka FGFR-1 w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami NI (dane nie przedstawione). Mechanizmy, które mogą przekazywać inne FGFR do skrętu w ludzkich osteoblastach z rodzaju Calvaria, muszą zostać zidentyfikowane. Następnie ustaliliśmy, czy zmniejszona dawka Twist indukowana mutacją Y103X Twist w zespole Saethre-Chotzen indukuje zmiany genów markera osteoblastów i syntezy macierzy podczas osteogenezy in vitro i in vivo. Mutacja początkowo zwiększała poziomy mRNA ALP i aktywność ALP niezależnie od wzrostu komórek w pojedynczej warstwie i podczas osteogenezy in vitro, co wskazuje, że Twist kontroluje ekspresję ALP i aktywność w osteoblastach ludzkiej kości. Co więcej, mutacja Twista sprzyjała powstawaniu struktur kostnych podobnych do kości in vitro i zwiększonej syntezie kolagenu typu I oraz ilości osadu matrycowego podczas osteogenezy in vitro. Doświadczenia z implantacją u nagich myszy potwierdziły zwiększoną zdolność zmutowanych osteoblastów Twist do tworzenia matrycy kolagenowej in vivo. Podsumowując, nasze dane wskazują, że skręcona utrata funkcji wywołana przez delecję domeny bHLH powoduje zwiększone odkładanie się osnowy kostnej przez zmutowane osteoblasty in vivo i in vitro. Ten fenotyp jest istotny dla ludzkiej choroby, ponieważ analiza histologiczna szwu koronowego u tego samego pacjenta z zespołem Saethre-Chotzen ujawniła zwiększoną depozycję włókienek kolagenowych na poziomie podokostnowym (dane nie przedstawione). Odkrycia te wskazują, że wzrost tworzenia kości matrycowej wywołany mutacją Twista w osteoblastach kości piętowej może przyczynić się do przedwczesnego skostnienia czaszki w zespole Saethre-Chotzen. Mutacja Twista nie wpłynęła podobnie na geny markerowe osteoblastów. Chociaż stwierdziliśmy, że zmniejszone dawkowanie Twist zwiększyło ekspresję ALP i COLIA1 podczas osteogenezy in vitro, mutacja Twist zmniejszyła ekspresję OC w osteoblastach ludzkiej kości piętowej. Ten efekt mutacji nie był związany z proliferacją komórek, ponieważ ekspresja tych genów była konsekwentnie zmieniana w zmutowanych komórkach niezależnie od wzrostu komórek. Co więcej, ta wada OC była komórkowa autonomiczna i nieodłączna dla osteoblastów, które wyrażają OC. Chociaż ostatnie badania transfekcji w komórkach kostniakomięsaka wskazują, że nadekspresja Twist może hamować różnicowanie osteoblastów (38), ekspresja OC, głównego genu markera osteoblastów, nie została określona. Niniejsze badania dostarczają, więc po raz pierwszy, pierwszego dowodu genetycznego, że delecja domeny bHLH Twist w ludzkich zmutowanych osteoblastach kości piętowej wpływa na ekspresję genu markera osteoblastu OC, oprócz promowania osteogenezy. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi dowodami genetycznymi wykazującymi, że myszy z niedoborem OC rozwijają fenotyp charakteryzujący się zwiększonym tworzeniem kości (39). Kilka mechanizmów molekularnych może być zaangażowanych w zmianę ekspresji OC indukowanej przez mutację Twist Y103X. Delecja domeny bHLH może hamować odpowiednią dimeryzację białek bHLH lub E (34), zapobiegając w ten sposób wiązaniu dimerycznych białek z komórkami E w docelowych promotorach i późniejszej transaktywacji genów specyficznych tkankowo (4). Wydaje się to mało prawdopodobne, ponieważ Twist nie wiąże pól E w promotorze OC (G. Karsenty, komunikacja osobista)
[przypisy: sanatorium nad morzem dla dzieci, fundacja dantis, tatuowanie gałek ocznych ]
[patrz też: olej z siemienia lnianego, centrum medyczne białystok, gorączka cda ]
