Płytki przepłukano zimnym PBS, utrwalono w 70% etanolu w temperaturze 4 ° C i inkubowano przez godzinę w 37 ° C z fosforanem naftolu AS-BI w buforze Tris (pH 8,5) w obecności soli LB o szybkim czerwonofioletowym kolorze. Liczbę guzków ALP + utworzonych w 8 dni przez komórki NI i M-Tw na centymetr kwadratowy oceniano pod mikroskopem przy x 125. W tych samych warunkach hodowli ekspresję genów markera Twist oraz wczesnego i późnego osteoblastu różnicowania (ALP, COLIA1, OC) określono w komórkach N1 i M-Tw w 4, 6 i 8 dniu hodowli, stosując analizę RT-PCR jako Opisane poniżej. W celu dalszego określenia fenotypu indukowanego przez mutację, przeprowadzono trzecią serię eksperymentów, stosując analizy histologiczne i biochemiczne. Komórki NI i M-Tw hodowano w agregatach, warunkach, które pozwalają na tworzenie macierzy i osteogenezę w hodowlach komórek ludzkich Calvaria (23, 26). Komórki hodowano z wysoką gęstością komórek (5 x 105 komórek / agregatu) na naczyniach o jakości bakteryjnej w obecności kwasu askorbinowego (25 .g / ml) z wytworzeniem agregatów. Po 14 dniach zebrano agregaty, utrwalono w 70% etanolu i osadzono w nierozkruszonym roztworze w metakrylanie glikolu (30). Cienkie (3-5 m) histologiczne skrawki wybarwiono trójchromem Goldnera w celu wizualizacji osadzania matrycy (30). Aktywność ALP w komórkach oznaczono za pomocą testu kolorymetrycznego (BioMérieux SA, Marcy Etoile, Francja), a kolagen typu zsyntetyzowany przez komórki określono na poziomie propago-peptydu na końcu karboksylowym typu (P1CP) uwalnianego do pożywki, co odzwierciedla syntezę kolagenu typu I, stosując specyficzny test radioimmunologiczny (Orion Diagnostics, Espoo, Finlandia). Wyniki znormalizowano dla zawartości białka. Analiza Western blot. Poziomy białka skrętnego określano w konfluentnych komórkach NI i M-Tw metodą analizy Western blot. Ekstrakty komórek jądrowych przygotowano zgodnie z opisem (31). Zawartość białka w supernatantach oznaczano przy użyciu testu DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Białka poddano SDS-PAGE przy użyciu 4. 15% żelu (Bio-Rad Laboratories Inc.) w celu detekcji Twista, i P-aktynę stosowano jako kontrolę wewnętrzną dla obciążenia białkiem. Białka przeniesiono na membrany PVDF (Hybond-P, Amersham Pharmacia, Saclay, France) w buforze zawierającym 20% metanolu. Błony inkubowano przez noc z 1% buforem blokującym (Roche Diagnostics, Meylan, Francja) w TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl) zawierającym 0,1% Tween-20, a następnie inkubowano z oczyszczonym przez powinowactwo kozim poliklonalnym Ab skierowanym przeciwko peptyd odpowiadający aminokwasom 172-188 mapującym na COOH-końcowej domenie ludzkiej Twist (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA) lub króliczym mAb wzbudzonym przeciwko (3-aktynie (Sigma Chemical Co.). Membrany następnie przemyto dwukrotnie TBS / 0,1% Tween-20 i 0,5% buforem blokującym i inkubowano przez godzinę ze skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową sprzężonymi (sprzężonymi z HRP) Abs wtórnymi. Po trzech przemyciach w TBS / 0,1% Tween-20 sygnał wizualizowano za pomocą substratu do analizy ECL Plus (Amersham Pharmacia). Analiza RT-PCR. Analizę mRNA dla markerów Twist i osteoblastów przeprowadzono w przedkonfluentnych i konfluentnych komórkach N1 i M-Tw oraz w trakcie tworzenia się guzków w opisanych powyżej warunkach hodowli. Ekspresję mRNA Twist, ALP, COLIA1 i OC analizowano za pomocą półilościowego RT-PCR. Optymalizację wyników RT-PCR przeprowadzono przez wytworzenie krzywych saturacji produktów RT-PCR każdego genu i GAPDH z liczbą cykli (0. 35 cykli) (25). Wybraliśmy ten sam numer cyklu (24 cykle) dla wszystkich genów, z wyjątkiem ALP (30 cykli), w którym wzmocnienie było liniowe. Komórki NI i M-Tw przemyto PBS i poddano lizie za pomocą odczynnika Ekstrakt-Wszystkie (Eurobio, Les Ulis, Francja) zgodnie z instrukcjami producenta. Trzy mikrogramy całkowitego komórkowego RNA z każdej próbki poddano odwrotnej transkrypcji, a próbki cDNA następnie podzielono i zamplifikowano, stosując specyficzne startery opisane wcześniej (20 pmol / probówka) dla ALP, COLIA1, OC i GAPDH (25). Primery dla Twist były sensowne: 5. -TCTTACGAGGAGCTGCAGAC-3. i antysensowny: 5. -TATCCAGCTCCAGAGTCTCT-3. i zostały zaprojektowane do amplifikacji sekwencji obejmującej domenę bHLH. Analizę Southern blot przeprowadzono przez przepuszczanie próbek amplifikowanego cDNA na 1,2% żelu agarozowym, a następnie przeniesienie na membranę nylonową zgodnie z protokołem producenta. Hybrydyzację błotów przeprowadzono przez noc w 50 ° C z wewnętrznymi starterami znakowanymi ATP (32P). Membrany przepłukano dwukrotnie w 2 x SSC / 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 10 minut, raz w 0,1 x SSC / 0,1% SDS w 50 ° C przez 10 minut, następnie eksponowano na filmy rentgenowskie.
[podobne: centrum medyczne białystok, mycie włosów szarym mydłem, ziaja krem liście manuka ]
[przypisy: tatuowanie gałek ocznych, konwerter jednostek długości, olej z ostropestu właściwości ]
