Sygnały autoradiograficzne oznaczano ilościowo za pomocą densytometru skanera. Sygnał dla każdego genu skorygowano dla GAPDH. Tworzenie macierzy in vivo. Tworzenie macierzy przez komórki NI i M-Tw określono również in vivo. Zawiesiny komórkowe hodowli Nl i M-Tw przygotowano przez powtórzenie dyspersji przez igłę 20 G; 107 komórek ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 2,5 ml DMEM plus 10% FCS i dodano do 3 mm ceramicznych kostek z hydroksyapatytu (HA) (CRITT, Maubeuge, Francja). Po niewielkiej próżni w celu uwolnienia kieszeni powietrznych z ceramiki kostki HA umieszczono na noc w 37 ° C, aby umożliwić przyczepienie komórek. Kostki następnie wszczepiono podskórnie (4. 6 jednostek HA na mysz) w tylnej części bezgrasiczych myszy (homozygota CD-1 nu / nu, 4-tygodniowa samica, Charles River, St. Aubin Les Elbeuf, Francja) utrzymywana pod kontrolowane środowisko. Kontrole składały się z kostek HA wszczepionych bez komórek. Po 4 i 8 tygodniach implantacji próbki HA usunięto, utrwalono w 70% etanolu i osadzono w postaci odwapnionej w metakrylanie metylu (32). Przekroje podłużne (o grubości około 5 .m) z próbek kości osadzonych w plastikowych barwnikach wybarwiano trójchromem Goldnera w celu identyfikacji matrycy kolagenowej (32). Matrycę utworzoną wzdłuż materiału HA wizualizowano na skrawkach barwionych za pomocą trichromu Goldnera, zmierzonych metodami histomorfometrycznymi (33) przy użyciu integrującego oka zamontowanego na mikroskopie Olympus (x 250) i wyrażono jako procent objętości osteoidy na całkowitą objętość implantu. Statystyka. Dane wyrażono jako średnią. SEM. Różnice między wartościami średnimi analizowano za pomocą pakietu statystycznego super-ANOVA (Macintosh, Abacus Concepts Inc., Berkeley, California, USA) z wartością P mniejszą niż 0,05 uważaną za mającą minimalne znaczenie. Wyniki Mutacja Y103X Twist zmniejsza dawkę Twist w zmutowanych komórkach Calvaria. Najpierw określiliśmy wpływ mutacji Y103X na ekspresję mRNA Twist i poziomów białka. Figura 2a pokazuje, że mRNA Twist wyrażano w komórkach Nl i M-Tw hodowanych w stanie przed konfluencją i konfluencji. Ilościowa analiza poziomów mRNA korygowanych dla GAPDH wykazała, że poziomy mRNA Twist były około 40% niższe w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami N1 (Figura 2c). Ponadto, analiza Western blot wykazała, że poziom białka Twist rozpoznawanego przez koniec C na końcu COOH był zmniejszony w komórkach M-Tw, jak przewidywano z delecji końcowej domeny COOH białka indukowanego przez mutację (Figura 2b). Dane te pokazują, że mutacja zmniejsza Twist mRNA i poziomy białka, co wskazuje, że dawka Twist jest zmniejszona w zmutowanych komórkach. Figura 2 Zmniejszona ekspresja mRNA Twist i białka Twist w zmutowanych komórkach Calvaria. Kontrolne (NI) i zmutowane (M-Tw) komórki kalibii hodowano we wstępnej konfluencji (PC, 2 dni) lub konfluencji (C, 4 dni) i oznaczano skrętne mRNA i poziomy białka. (a) Całkowity komórkowy RNA poddano odwrotnej transkrypcji i cDNA powielono przez PCR w celu zbadania ekspresji transkryptów Twist lub GAPDH, a następnie analizy Southern blot. (b) W konfluencji (4 dni), równe podwielokrotności lizatów komórek jądrowych zbadano pod kątem białka Twist, stosując analizę Western blot sondowaną poliklonalnym oczyszczonym COOH-Twist Ab lub monoklonalnym P -actinowym Ab i wykrywano przez wzmocnioną chemiluminescencję. (c) Analiza densytometryczna poziomów mRNA Twist po korekcji GAPDH (średnia . SEM z trzech eksperymentów, AP <0,05 w porównaniu do komórek N1). Zredukowana dawka skrętu zwiększa wzrost komórek ludzkiej calvarius. Wpływ mutacji Twist powodującej zmniejszenie dawki Twist określono następnie na proliferację komórek Calvaria. Synteza DNA była wyższa w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami N1 w do 6 dni hodowli (Figura 3a). Zliczanie komórek wykazało, że tempo wzrostu komórek M-Tw było dwukrotnie większe niż w komórkach N1 (Figura 3b), potwierdzając zmianę w syntezie DNA. Dane te wskazują, że mutacja Y103X Twist powodująca zmniejszone dawkowanie Twist skutkuje zwiększoną proliferacją komórek osteoblastów kalibii in vitro. Figura 3 Zmniejszone dawkowanie skręcające zwiększa wzrost komórek w zmutowanych osteoblastach. Komórki kontrolne (NI) i zmutowane (M-Tw) z komórek Calvaria z mutacją Y103X Twist wysiewano przy tej samej gęstości komórek (20 x 104 komórek / cm2), a syntezę DNA i liczbę komórek określano w odstępach czasu. Analiza przebiegu czasowego pokazuje, że zarówno synteza DNA (a), jak i liczba komórek (b) były podwyższone w komórkach M-Tw w porównaniu z komórkami NI. Dane są średnie. SEM z czterech kultur. AP <0,01 vs. komórki Nl. Zredukowana dawka skrętu hamuje ekspresję OC. Aby zbadać wpływ mutacji Twista na różnicowanie komórek niezależne od wzrostu komórek, wczesne i późne geny markerowe osteoblastów oznaczono w komórkach N1 i M-Tw hodowanych w podobnych warunkach gęstości (wstępne lub konfluencji) [przypisy: fundacja dantis, anielskie smaki, ciąża miesiąc po miesiącu ] [hasła pokrewne: słód jęczmienny gdzie kupić, ciąża miesiąc po miesiącu, zus dobrowolne ubezpieczenie zdrowotne ]
